本发明属于细胞工程，具体涉及一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法。

背景技术：

1、食蟹猴(macaca fascicularis raffles)，又名长尾猴、爪哇猴，属于灵长目猴科属动物。食蟹猴作为非人灵长类动物，在组织结构、病理、生理、代谢及免疫调节等方面与人类高度相似，是研究人类疾病病理生理特征及诊疗手段的理想模式动物。

2、骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells，bmmncs)是一群混合细胞，其中包含众多目前研究证实具有重要治疗潜力及生物学功能的细胞类型，如间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞、单核细胞和t细胞等，这些细胞正被广泛应用于人类疾病机理及诊疗方法的研究中。

3、目前报道的单个核细胞的分离方法多是以外周血为主体展开的，主要有密度梯度离心法、流式细胞仪分选法及免疫磁珠法等。此外，近年来也出现了一些基于上述分离方法的单个核细胞分离试剂盒。其中，流式细胞仪分选法及免疫磁珠法对细胞损伤较大，且价格成本相对较高，而密度梯度离心法相对而言成本更低，因而得到了广泛应用。但目前常用的骨髓单个核细胞分离法对技术人员的操作要求较高，且由于骨髓与外周血的密度等理化特征并不完全一致，导致基于外周血分离得到的单个核细胞存活率较低。比如，中国发明专利cn104774805a公开了一种分离骨髓单个核细胞的方法，利用明胶溶液破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉积，进而避免mncs可能混杂红细胞，不利于mncs收集的问题。但该方法对于单个核细胞的存活率没有显著影响，不能有效提高单个核细胞的存活率。同时，目前尚无专门针对食蟹猴骨髓单个核细胞分离方法的报道。因此，寻找一种适用于食蟹猴骨髓单个核细胞的简便分离方法具有十分重要的现实意义。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，解决了目前常用的骨髓单个核细胞分离法对技术人员的操作要求高，且分离后的细胞存活率较低的问题。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明提供了一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，所述分离方法包括以下步骤：

4、s1、将食蟹猴新鲜骨髓与含肝素钠rpmi-1640培养基混匀，再将其加入ficoll-paque premium分离液中，室温静置后离心弃上层液体，并吸取中间白色层细胞，即为骨髓单个核细胞；

5、s2、将骨髓单个核细胞与rpmi-1640培养基混合均匀，离心弃上清后即得到食蟹猴骨髓单个核细胞。

6、优选地，步骤s1中，所述食蟹猴新鲜骨髓与ficoll-paque premium分离液的体积比为3:3-7。食蟹猴新鲜骨髓与ficoll-paque premium分离液的体积比更优选为3:3-5。

7、本发明使用含有肝素钠的rpmi-1640培养基稀释食蟹猴骨髓样本，并优化ficoll-paque premium分离液与骨髓样品的比例，使分离得到的食蟹猴骨髓单个核细胞具有更好的细胞活性，且操作简单方便，是一种适用于食蟹猴骨髓单个核细胞分离的方法，有望解决目前常用的骨髓单个核细胞分离法对技术人员的操作要求高，且分离后的细胞存活率较低的问题。

8、优选地，步骤s1中，所述食蟹猴新鲜骨髓与含肝素钠rpmi-1640培养基的体积比为3:2-5。食蟹猴新鲜骨髓与含肝素钠rpmi-1640培养基的体积比更优选为3:2-3

9、优选地，步骤s1中，所述含肝素钠rpmi-1640培养基的肝素钠浓度为9000-12000u/ml。含肝素钠rpmi-1640培养基的肝素钠浓度更优选为10000u/ml。

10、优选地，步骤s1中，所述ficoll-paque premium分离液的密度为1.085g/ml。

11、优选地，步骤s1中，所述离心为18-20℃恒温条件下，800g升速5-9降速2-5条件下离心20-30min。

12、优选地，步骤s2中，所述离心为18-20℃恒温条件下，200-500g离心4-10min。

13、优选地，步骤s1、s2均在室温(23-25℃)条件下、生物安全柜内操作(离心除外)，并严格遵守无菌操作。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

15、本发明使用含有肝素钠的rpmi-1640培养基稀释食蟹猴骨髓样本，并优化ficoll-paque premium分离液与骨髓样品的比例，优化出一种适用于食蟹猴骨髓单个核细胞分离的方法。利用本发明方法分离的食蟹猴骨髓单个核细胞具有更好的细胞活性，且操作简单方便，克服了目前常用的骨髓单个核细胞分离法对技术人员的操作要求高，且分离后的细胞存活率较低的问题。

技术特征：

1.一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s1中，所述食蟹猴新鲜骨髓与含肝素钠rpmi-1640培养基的体积比为3:2-5。

3.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s1中，所述含肝素钠rpmi-1640培养基的肝素钠浓度为9000-12000u/ml。

4.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s1中，所述食蟹猴新鲜骨髓与ficoll-paque premium分离液的体积比为3:3-7。

5.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s1中，所述ficoll-paque premium分离液的密度为1.085g/ml。

6.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s1中，所述离心为室温条件下，800g升速5-9降速2-5条件下离心20-30min。

7.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s2中，所述离心为室温条件下，200-500g离心4-10min。

8.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤s1、s2均在室温条件下、生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。

技术研发人员：官堂明,李文德,袁君茹,高洪彬,贾欢欢,陈思羽,叶晓兰,赵志斌,卞振华,罗攀月,万红平,唐爽捷,李永锋受保护的技术使用者：广东省实验动物监测所技术研发日：技术公布日：2024/5/29