Gateway入门克隆 |
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入门克隆包含您感兴趣的基因或attL 序列插入的DNA片段，然后与 attR 序列重组，生成您所需的表达克隆。可以使用三种方法来生成入门克隆：BP 克隆，限制酶和连接酶克隆以及 Invitrogen TOPO 克隆到 Invitrogen Gateway 入门载体中，这是最常见的方法。 入门载体选择指南 订购信息 Gateway 入门载体选项 RNAi 表达—通过慢病毒和腺病毒 Gateway 载体，在任何哺乳动物细胞类型中均可高效递送并长期稳定或瞬时表达 shRNA病毒表达—在任何哺乳动物细胞类型中高水平、稳定和瞬时基因表达体外蛋白合成—无需特殊设备，只需 2 小时即可在单个反应管中直接合成高产量的重组蛋白。缩放反应以达到从微克到毫克级别的蛋白水平体内生物素化—表达、纯化和检测生物素化重组蛋白的简便有效方法。按需标记技术—从某种载体产生天然或标记的蛋白。 构建一个入门克隆导向入门克隆的三种可能方法如图 1 所示。使用 TOPO 载体和 PCR 扩增/限制酶载体是构建自己的入门克隆的最常见方法。 图 1.构建入门克隆的策略构建入门克隆的方法有三种：(A) BP 克隆； (B) TOPO 克隆，和 (C) 限制酶和连接酶克隆。红色箭头表示目的片段。摘自 Katzen F (2007) Expert Opin Drug Discov 2(4):571–589。 TOPO 克隆我们提供两种类型的 TOPO 载体，这些载体可轻松进行 TOPO 克隆以创建 Gateway入门载体。pCR8/GW/TOPO 载体试剂盒和 pENTR / D-TOPO 载体系列均可提供 5 分钟的高效TOPO 克隆，效率 > 95%。 pENTR/D-TOPO 载体试剂盒pENTR/D-TOPO 载体利用了快速高效的定向 TOPO 克隆技术，可以以正确的方向表达您的插入片段。这些载体包含必需的 attL 序列，可重组进任何目标载体中，某些载体带有 TEV 蛋白酶酶切位点，可用于表达后天然蛋白的制备（图 2）。 图 2.多种 pENTR 载体可用于定向 TOPO 克隆，可直接使用多种Gateway 表达载体。 pCR8/GW/TOPO 载体试剂盒pCR8/GW/TOPO 载体可实现高效 TOPO-TA 克隆。这些载体有利于实现多种用途：快速重组进多种 Gateway目标载体中，方便的测序，利用壮观霉素抗性在大肠杆菌中进行稳定地筛选，以及轻松切除两端带有 EcoR I 位点的插入 DNA（图 3）。
图 3.pCR8/GW/TOPO 入门载体允许 TOPO TA 克隆用于多个下游应用。 入门载体选择指南 等级试剂盒货号优势TOPO 克隆的载体最好高效、定向 TOPO 克隆载体试剂盒pENTR/TEV/D-TOPO 克隆试剂盒K253520定向 TOPO 克隆用于去除 N 端标签的 5’ TEV 序列包含快速生长的大肠杆菌，可缩短微量制备的时间pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒K240020定向 TOPO 克隆pENTR/SD/D-TOPO 克隆试剂盒K242020定向 TOPO 克隆载体包含 Shine-Dalgarno 序列，用于大肠杆菌表达的入门克隆pENTR/TEV/D-TOPO 克隆试剂盒K252520定向 TOPO 克隆用于去除N 端标签的 5’ TEV 序列非常好高效 TOPO TA 克隆载体试剂盒pCR8/GW/TOPO TA 克隆试剂盒K252002高效 TOPO TA 克隆试剂盒包含快速生长的大肠杆菌，可缩短微量制备的时间包括质粒纯化组分，以提供最大的便利pCR8/GW/TOPO TA 克隆试剂盒K252020高效 TOPO TA 克隆试剂盒包含快速生长的大肠杆菌，可缩短包含快速生长的大肠杆菌，可缩短微量制备的时间pCR8/GW/TOPO TA 克隆试剂盒K250020高效 TOPO TA 克隆试剂盒简化了入门克隆的构建用于 PC 扩增或限制酶克隆的载体标准限制克隆载体pENTR 1A 双重选择载体A10462限制酶克隆载体，可产生 in-frame（rf = 0），易于表达的入门克隆，包括 Shine-Dalgarno 和 Kozak 序列pENTR 2B 双重选择载体A10463限制酶克隆载体，可产生 in-frame（rf = +1），易于表达的入门克隆氯霉素和卡那霉素的筛选pENTR 3C 双重选择载体A10464限制酶克隆载体，可产生 in-frame（rf = +2），易于表达的 入门克隆氯霉素和卡那霉素的筛选pENTR 4 双重选择载体A10465与 pENTR 1A 载体相同，除了在 MCS 中用 Nco I 代替 Dra I 产生 in-frame（rf = 0），易于表达的入门克隆氯霉素和卡那霉素的筛选pENTR 11 双重选择载体A10467与 pENTR 1A 载体相同，除了在 MCS 中用 Nsp V代替 Dra I 产生 in-frame（rf = 0），易于表达的入门克隆氯霉素和卡那霉素的筛选购买预制克隆您还可以利用 Gateway 技术，从大量克隆集中选购可直接使用的克隆。Thermo Scientific™ Ultimate™ ORF 克隆集中包含插入序列经过全长测序的高质量人类和小鼠开放阅读框，这些阅读框已克隆到pENTR 221 Gateway入门载体中，可用于各种下游分析实验。克隆包含经过 DNA 和氨基酸序列验证的、可直接表达的 cDNA，用于激酶、G蛋白相关、磷酸酶、离子通道、G 蛋白偶联受体(GPCRs)、趋化因子、核受体和细胞因子。 参阅 Ultimate ORF 克隆选择指南 K250020,K252002,K252020,K252020SC,K250020SC,A10467,A10462,A10463,A10464,A10465,K59120,K243520,K240020,K263520,K242020,K253520,K252520 相关资源 克隆工具和资源Gateway 载体选择工具 定制克隆服务分子克隆支持中心Gateway 开放式架构方针Gateway 克隆实验流程基因合成服务Gateway 引用和参考文献Katzen F (2007) Gateway recombinational cloning: a biological operating system.Expert Opin Drug Discov 4:571–589.相关产品MultiSite Gateway 克隆技术Gateway Clonase 重组酶 Gateway Destination 载体供体载体手册Gateway 重组克隆手册Gateway 技术手册使用 Clonase II 的 Gateway 技术手册Gateway pENTR 载体手册Gateway pDONR 载体手册 |
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