一、引言

EP28上篇文章已经重点给大家分享了参考区间过程中相关定义和其关联性，以及建立参考区间的方案大纲和主要步骤，相信大家对定义及如何建立参考区间都有了一定的了解。

EP标准解读：定量IVD产品建立参考区间必须了解的干货（EP28）

参考区间建立后，有可能需要进行参考区间转移及其验证（如更新分析方法），而且建立可靠的参考区间的工作量非常大，成本也比较高，所以很多企业都倾向于选择参考区间转移的方式来确认自己产品的参考区间。

那么如何进行参考区间转移及验证，也就自然而然地成为了很多企业重点关注的内容，接下来将会一一为您详细解读。

二、参考区间的转移和验证大纲

本篇主要从参考区间转移和验证两大部分进行分享，主要内容如下图所示：

三、参考区间转移

1.参考区间转移的原因

1）建立及确定可靠的参考区间的工作量非常大，而且成本也比较高，因此能够通过一些较便宜和更便捷的途经将参考区间从一个实验室转移到另一个实验室是非常有用的；

2）越来越多的新实验室和方法引入到实验室，期望每个大大小小实验室都建立明确自己的参考区间是不现实的。

2.参考区间转移条件及途经

2.1 参考区间转移需要满足的条件：

a.分析系统的可比性；

b.测试主体人群的可比性

注：前提是原始参考值研究进行得都正确。

2.2 参考区间转移条件及途经

2.2.1转移----分析系统的可比性

在某些情况下，实验室按照上篇参考区间建立的方案为主体人群建立了特定分析物的特定方法的参考区间。如果实验室决定改变方法，实验室可以通过品评估两种方法的比较研究来判读是否可以用来更新现有的参考区间或者是否真的需要一项新的研究。

主要优点：可以避免实验室从参考个体中获得样本，因此可以使用来自任何患者的新鲜样本（即，不一定是参考个体）来调查这些方法之间的关系。

1）分析系统可比性如何判断？

一般而言，两种方法具有相似的不精确度和已知的干扰，使用相同或可比的标准或校准品，并提供可以接受的可比值。只有满足分析系统可比性，方可以进行参考区间的转移。

为了更直观和清楚的理解，下面小编为大家两个举例。

示例1：分析方法具有完全可比性：

使用两种方法下测量的数据（根据原方法下数据建立的参考区间为50~150），得出线性回归方程式（如y = 1.004x – 0.628, r2 = 0.990）

可比性分析：极大的相关系数（r）、较小的正斜率偏差（1.004）、较小的负截距（-0.628）

参考区间转换：

新参考区间下限=50*1004-0.628=49.57（约等于50）

新参考区间上限=150*1004-0.628=149.97（约等于150）

所以新方法下的参考区间也是50-150。

示例2：检测结果高度相关，但有一种分析方法给出的结果比例性地偏高或偏低（例如，在37°C而不是30°C时测量酶活性）：

使用两种方法下测量的数据（根据原方法下数据范围50-250，建立的参考区间为50~150），得出线性回归方程式（如y = 1.57x – 0.832, r2 = 0.990）

可比性分析：极大的相关系数（r）、较大的正斜率偏差（1.004）、仍然较小的负截距（-0.832）

参考区间转换：

新参考区间下限=50*1.57-0.832=77.72（约等于78）

新参考区间上限=150*1.57-0.832=234.82（约等于235）

所以新方法下的参考区间是78-235。

2）通过分析方法可比性用转移来建立新方法下的参考区间，需要注意以下4点：

a.在做分析方法可比性判断时，需要严格遵循EP09《使用患者样本的测量程序比较和偏差估计》相关内容。使用适当的参考值分布比较重要，如果使用太小的样本范围，相关性可能看起来比实际更差，如果使用了太大的样本范围（即许多极低和极高的值），人们可能会高估相关性的质量。

b.使用线性回归时，对比观察截距的大小与数据范围以及参考区间是至关重要的。如果截距相对于参考区间相对较大，那么方法偏差可能不容许简单的转移。在这种情况下，建议实验室使用来自参考个人的样本来建立参考区间。

c.当参考值范围比较窄，都是离散整数，这种情况下线性回归就不是用来比较两组数据的最好最合适的工具，建议通过校正两种方法之间的平均偏差，采用简单的平均差来设置参考区间。

d.即使通过转移可以建立新方法下的参考区间，但也建议实验室用参考个体的小样本（如n=20）来验证该参考区间（具体详见后续出稿文章）。对于设有多个子类的参考区间的情况，如果在一个子类上验证了参考区间，允许所有其他子类的参考区间不用再单独进行验证了。

2.2.2 转移----测试主体人群的可比性

如果一个临床实验室希望转移由另一个实验室或诊断测试制造商建立的相同或可接受的可比分析系统的参考区间，那么转移问题就是参考人群的可比性问题了。此外，参考值研究中的其他分析前因素也必须具有可比性（如参考个体的准备、样本的收集和处理）。

在这种情况下，建议使用下文第四节中描述的三种验证方法中的一种进行验证。

四、参考区间验证

如上节所述，通过参考区间转移的方式建立新的参考区间后，需要进一步验证，主要的验证方法有三种：

主观验证

对相对较少的参考个体（如n = 20）进行验证

对较多的参考个体(但小于n =120）进行验证

下面小编就给大家逐一介绍这三种参考区间验证的方法。

1.主观验证

通过对原始适当参考值研究的相关因素的仔细检查，可以相对主观地评估转移的可接受性。为了能够做到这一点，必须做到如下两点：

a.充分描述所有参考人群统计变量和地理位置，并可供审查。

b.必须充分说明分析前和分析过程中的细节、分析性能、一整套完整的参考值以及最初建立参考区间的方法。

经过评估后，这些因素与接收实验室的操作过程和测试主体人群一致，那么参考区间可以转移，接收实验室除了以上涉及文件，不需要再进行任何验证研究。

2.使用相对较少的参考个体验证

用户或接收实验室可能希望，或可能被要求，验证由制造商或其他供体实验室报告的参考区间的转移。转移的可接受性可以通过检查来自接收实验室自己的受试者群体中较少数量的参考个体（n = 20），并将这些参考值与更大、更充分的原始研究进行比较来评估。

注：

a.原始参考值研究的分析前和分析过程中因素需要与接收实验室的操作相一致。

b.如果已知的两个种群的地理位置或人口统计学变量存在重大差异，从而导致参考值的差异，那么再进行参考区间转移就没有什么意义了。

转移验证研究步骤：

①选择的参考个体应适当地满足排除和划分标准并能代表接收实验室的健康人群

②根据参考区间建立的要求获得参考值

③检查测试结果，以确保没有一个结果是离群值（参考上篇离群值确认及处理方法Reed/Dixon或Tukey方法）

④如有离群值，应该获得新的样本替代他们，最终获得了20个没有离群值的测试结果；

⑤验证结果判定

验证结果判定流程图：

验证结果判定描述：

Step 1: 如果20名受试者的值中不超过2名（或测试结果的10%）超出原始宣称的限值，制造商或供者实验室报告的95%参考限值可被认为在接收实验室有效；

Step 2: 如果3个或4个测试结果超出了原始宣称的限值，需要按照上述要求重新获得20个没有离群值的相似的参考样本；

Sept 3: 对这20个没有离群值的测试结果进行步骤1的分析(如符合，不需要进行步骤4)；

Step 4: 如果3个或4个测试结果超出了原始宣称的限值（或在第一次中的20个测试结果中就有5个及以上）超出了原始宣称的限值，重新检查所使用的分析程序，接收实验室需要考虑两个参考人群的生物学特征可能存在的差异，并考虑是否应根据完整的研究指南建立自己的参考区间。

3. 使用相对较多的参考个体验证（小于n=120）

分析物参考区间对该分析方法的临床诊断释义至关重要，实验室可以选择更广泛的参考间隔转移研究。可以通过检查来自接收实验室自己的受试者群体中较多数量的参考个体（如n=60），并将这些参考值与更大、更充分的原始研究进行比较来评估。

注：

a.原始参考值研究的分析前和分析过程中因素需要与接收实验室的操作相一致；

b.如果已知的两个种群的地理位置或人口统计学变量存在重大差异，从而导致参考值的差异，那么再进行参考区间转移就没有什么意义了；

c.这类更大规模的研究对于发现原始参考价值研究和接收实验室受试者人群之间的差异具有更大的统计意义。

转移验证研究步骤：

Step 1: 按照要求选择的参考个体并获得没有离群值的测试结果；

Step 2: 将测试结果与完整的原始数据进行比较；

Step 3: 如果没有显著差异，可以进行转移，如果有显著差异，则应进行进一步的比较或进行全面的参考值研究。

注：

a.这两组参考值可以用相同的方式进行处理，以确定参考总体中是否存在子类

如上篇文章所述，对于60个参考个体的样本，鲁棒法可以允许建立具有合理狭窄的置信限的参考区间。但是每个实验室都需要在逐个分析的基础上决定，这种参考区间的置信限是否足够狭窄，以满足临床诊断释义的需求。

总结

鉴于按照指南要求严格建立及确定可靠的参考区间的工作量非常大，而且成本也比较高，很多企业也会尽可能地择优选择通过转移和验证的方式来建立自己的参考区间，相信通过以上参考区间转移和验证的方法和步骤分享，您应该大致清楚了主要的流程及要求，清楚了如何在满足法规要求的基础上高效地为自己产品的建立对应的参考区间。