如上节所讨论的实验装置，核酸电泳工作流程需要执行若干步骤，每一步都可能影响核酸分离的结果。 本页面主要讨论与样品、试剂和运行参数相关的7大额外注意事项，包括:

电泳基本原理表明，不同大小的核酸样品，具有不同的迁移性。 但是，在电泳过程中，具有相同数量核苷酸，不同序列组成和构象的核酸也可能有不同的迁移性(图1)。

图 1. 构象不同的相同DNA的电泳迁移。 (A) 带切口环状、线性、超螺旋质粒DNA的电泳。 (B) 松弛型环状、线性和超螺旋质粒DNA的构象。 带切口质粒是一个松弛、开放的环状构象，体积大，凝胶中迁移缓慢；线性质粒迁移速度稍快；完好无损的质粒最紧凑，迁移速度最快。

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有关琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶的选择，主要取决于需分离核酸样品的大小和所希望达到的分辨率(了解更多有关 两种凝胶的信息)。 一般而言，高百分比凝胶适用于分离小分子，效果好。 表1归纳了核酸电泳选择琼脂糖和丙烯酰胺凝胶试剂时需考虑的性能。

硫酸铵(APS)溶液最好是现配现用，用于形成自由基启动凝胶聚合。 在4°C条件下，制备的原液可储存约一个月,但效率会随时间下降。

四甲基乙二胺 (TEMED)是稳定凝胶聚合中形成的自由基试剂,应密封存储,以防止氧化。

硫酸铵(APS)溶液最好是现配现用，用于形成自由基启动凝胶聚合。 在4°C条件下，制备的原液可储存约一个月,但效率会随时间下降。

四甲基乙二胺 (TEMED)是稳定凝胶聚合中形成的自由基试剂,应密封存储,以防止氧化。

图 2. (A)电泳过程中，缓冲液阳离子相对于核酸移动。 (B)琼脂糖结构单元氧的位置上，可携带负电荷基团(由X表示)。

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凝胶厚度和孔径大小，包括琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶，也可影响电泳结果[3]。

一般而言， 较厚的凝胶 运行过程中产生热量也较多，可导致条带扩散。 由于凝胶染色的高背景或凝胶染色和/或脱色所需时长(如进行 电泳后染色 )，可能会出现可视化不佳的情况。 对于 琼脂糖 凝胶，厚度以3 - 4 mm为佳，不推荐超过5 mm厚度的凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶 的厚度由制造商提供的用于凝胶灌制的垫片决定，最常见的是0.75 mm,1.0 mm,1.5 mm。

而由 胶梳形状决定的 孔径大小，不仅影响样品的装载量，而且会影响条带的分辨率。 虽然较大的孔可容纳更大的样品负载，但同时也会产生粗条带，减少条带分辨率并产生污点。 而长而窄的孔可容纳的样品量虽小，但可提供更清晰的条带，以获得更好的分辨率。 减少高密度样品的进样量可提供更高强度的条带。

核酸电泳中常用的两种运行缓冲液为 Tris-醋酸 EDTA (TAE)和 Tris-硼酸盐EDTA (TBE)[5](参见 上节凝胶运行步骤)。 低分子量样品(如DNA < 1000bp)用具有较高离子强度和缓冲能力的 TBE 缓冲液分离效果较好；较大的DNA片段在TBE缓冲液中分离效果不佳。 用于分离生成二级结构的分子（例如RNA）的变性电泳，通常采用TBE缓冲液，因为聚丙烯酰胺凝胶主要使用 添加了7-8 M尿素 或类似变性剂的TBE缓冲液，以维持核酸的单链状态。

分离分子量较大(例如，DNA≥12-15 kb)的核酸,优先考虑低场强（1–2 V/cm)TAE 缓冲液。 TAE缓冲液可促进凝胶产生较大尺寸孔隙，减少 电内渗 (为带电相对较少的缓冲液)，并降低电场强度，以降低大分子产生污点的趋势[6]。

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通过电泳分离样品，施加电场后带负电荷的核酸向正极迁移。 因此，电泳的电气参数可以影响样品的迁移和组成其片段的分辨率[7,8]。

根据欧姆定律推导出的下列方程，可用来展示电压(V)、电流(I)和功率 (P) 如何影响电泳结果。

电压=电流x电阻，即V = I x R ，功率=电流x电压，即 P = I x V ，因为V = I x R，功率也可表示为 P = I2 x R。

在凝胶运行过程中，电阻(R)是系统的固定参数。 例如，系统的缓冲液(电导率和缓冲能力)、温度、凝胶性能(百分比、高度、长度、数量、截面)等，都会影响电阻。 在导电介质中，较高温度可允许更多的电流流动，所以温度升高电阻减小。。 然而，在凝胶运行过程中，电阻可能会有所不同。

影响电泳的另一重要因素是热量。 产生的热量与系统消耗的能量成正比，而且取决于缓冲液电导率、施加的电压和电阻。 缓冲液的导电性越高(特别是由小离子组成)，电流越高。 高电压和低电阻也可提高电流。 整体电流的增加,增加了系统产生的能量和热量。

表2 描述了电阻和热如何影响恒压、电源和电流对电泳系统的影响。 无论 电源是否提供恒定电气参数，电压的上限应略低于系统的最大值，以避免过热导致设备和样品的损坏。 一般建议设置可实现样品有效分离且不会产生过多热量的电气参数。 

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电泳中，荧光染料 常用于核酸样品染色，使其可视化。 除灵敏度外，染料的激发波长、结合亲和性、凝胶渗透速度等特性也可影响电泳的工作流程和应用 (表3)[9]。

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核酸样品染色的两种常用方法，包括:

(1) 凝胶内，染色剂与凝胶(和运行缓冲液)相结合 (2) 电泳后，运行完成后，凝胶单独浸泡染色。

两种方法各有优劣势，如 表4所示。

凝胶内染色 更方便，可视化只需较少染料。 然而，带正电的染色剂与核酸的迁移方向相反，会影响低分子量样品的检测，特别是在长时间运行的情况下(图 3A)。 此外，与核酸结合的染料会改变样品的迁移，即凝胶迁移，导致样品的大小与实际不符(图 3B)。 此外，在凝胶中加入高水平嵌入染料可能会改变超螺旋质粒DNA的构象，改变其在电泳中的迁移性(表观分子量)[10]。

因为 电泳后染色不影响样品的检测，是准确测定样品大小的首选方法。 然而，该方法工作流程时间较长，所需染料较多，使用如溴化乙锭等染料时也会产生更多的有害废物。

图 3. 用嵌入染料进行核酸凝胶电泳的结果。(A) 在凝胶中加入的溴化乙锭 与核酸的移动方向相反。 黄线标志着溴化乙锭荧光背景和染料被耗尽的凝胶区域之间的边界。 (B) 一种大型的嵌入染料，被加入凝胶中而不是应用于电泳后染色时，会影响样品条带的迁移。 为说明这种影响，两个分子量标准在两个凝胶中并排运行。 高分子量的分子量标准(1列)在两种凝胶中都有相似的迁移(蓝线标示参考条带，显示条带位置)。 在电泳过程中，低分子量的分子量标准(2列)在含有染料的情况下迁移不同。

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综上所述，在电泳中除 工作流程设置外，选择合适的试剂、参数和方法，对实现最佳核酸分离和分析至关重要。