单基因如何干湿结合发5分+泛癌分析 |
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单基因如何干湿结合发5分+泛癌分析
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今天和大家分享的是2020年1月发表在EBioMedicine（IF：5.736）上的一篇文章，作者通过单因素、多因素cox回归分析、KM生存分析等途径建立了TP63亚型的表达对TCGA-膀胱癌（BLCA）及泛癌的差异预后效应，同时首次构建出了TP63在BLCA中的完整亚型列表。 标题：TP63 isoform expression is linked with distinct clinical outcomes in cancer TP63亚型表达与癌症的不同临床结果有关 一、 研究背景 在多方式的积极治疗下，50%的肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)患者仍将发展为致命的转移复发。因此，识别预后生物标志物，以确定患者的复发和死亡风险是至关重要的。TP63通常在膀胱和其他类型的癌症中表达，但它在肿瘤生物学和预后指标中的作用尚不清楚；它可以表达为多个独特的异构体，根据它们表达的氨基端结构域可分为DNp63和TAp63两类。先前的研究表明，这些不同的TP63亚型在肿瘤生物学和患者预后中具有不同的作用，但TP63亚型的表达尚未系统地描述并与临床结果相关。 二、 分析流程  三、 结果解读 1.泛癌中TP63的表达水平及其与生存的关系作者从TCGA中29个疾病队列中下载了z-score标准化的RNA-seq数据（8519例），以z-score作为标准化后的数据，得到在泛癌中TP63.表达水平较高的几种癌症类型，其中包括BLCA（图1.a）利用单因素cox回归分析，发现TP63的高表达与以TCGA-低级别胶质瘤（LGG）、TCGA-皮肤黑色素瘤（SKCM）为代表的的癌症队列的生存率降低显著相关；而与以TCGA-乳腺癌（BRCA）等为代表的癌症队列的生存率提高显著相关 （图1.b）接下来作者针对TP63表达与BLCA患者预后的关系进行分析，首先对BLCA队列患者进行TP63高/低表达的分组（取最低的10%分位数作为分界），接着对TP63高/低表达分组做kaplan-meier(KM)生存分析，结果显示高表达组BLCA患者的中位OS（44.8mos）明显高于低表达组的中位OS（19.8mos）（图1.c、d）对BLCA不同分子亚型做cox回归分析，发现TP63表达与腔内分子亚型患者生存率提高有显著相关性；而与基础鳞状亚型患者生存率的相关性不显著，这一结果提示了TP63对预后的差异效应可能与癌症的分子亚型有关（图1.e） 图1.泛癌中的TP63表达水平及其生存分析 2.构建BLCA中TP63亚型的完整列表在Refgene和Gencode数据库中共有14个TP63亚型，而在BLCA队列的至少7%（28名患者）样本中又鉴定出两个额外的TP63异构体，在这里作者将两种异构体称为DNp63αP和DNp63βP， 为了证实DNp63αP和DNp63βP亚型在人膀胱癌中确实表达，作者构建了一组引物（如图2.c）图2.b显示利用cufflinks获得的TP63异构体目录，同时也是制作引物（图2.c）的依据用构建好的引物做qPCR。253J和UM-UC10细胞株的内源性TP63表达较低，作为阴性对照。；DNp63α过表达的UM-UC10细胞株作为阳性对照。只有当DNp63α异构体被过表达时，对应于TP63α的PCR产物才能在UM-UC10中被稳定地检测到。以上结果表明：DNp63αP和DNp63βP两种亚型存在于人膀胱癌细胞中（图2.d） 图2.BLCA中TP63亚型的鉴定过程 3.TP63亚型表达的定量作者考虑了多个异构体量化算法(Salmon、Kallisto和Cufflinks)后，使用了量化预测结果与TP63亚型的RT-PCR结果最接近的salmon算法，以下是作者对salmon算法准确性的检测。首先，给出用salmon算法计算出的BLCA队列中的TP63亚型表达水平，以及原发性膀胱癌队列、UMICH膀胱癌细胞系中的TP63亚型表达水平，得出一致的结论：DNp63是膀胱癌中的主要TP63亚型，TAp63的表达相对较少（图3.a、b、c）对TP63的prime和non-prime型异构体进行RT-PCR，将结果与基于salmon算法的定量结果进行比较，发现结果中都出现了prime亚型高表达，且两种方法得到的表达比例接近（图3.d、e）对TP63的α、β、δ异构体进行RT-PCR，将结果与基于salmon算法的定量结果进行比较，发现在两种方法得到的结果中α、β、δ异构体的表达比例基本一致（图3.f、g）；由以上两点结果证实了使用salmon算法可以准确的预测TP63亚型的表达为了在蛋白水平检验TP63亚型的表达水平是否与在mRNA水平上的一致，作者对总TP63和TP63α进行了immunoblot（免疫印迹）。结果显示：DNp63α分别占UM-UC5和UM-UC14细胞系中TP63蛋白表达总量的84%和80%；而基于salmon的定量结果显示，在UM-UC5和UC14中DNp63α的表达对应于TP63mRNA总量的90%和91%。这一结果让DNp63是BLCA中的表达的主要亚型有了说服力（图3.h）对TCGA泛癌队列绘制TP63亚型表达水平的热图，除个别例外，基本与BLCA中的亚型表达比例一致。（图3.i） 图3.用salmon算法进行TP63亚型定量的准确性验证 4.不同TP63亚型对BLCA不同分子亚型的预后影响分析TP63亚型在基底鳞状（BS）、腔乳头（LP）、腔浸润、腔和神经内分泌亚型中的表达谱有明显差异：DNp63亚型在LP和BS亚型中的表达明显高于其他亚型(Wilcoxon p |
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