摘要：面肩肱型肌营养不良症是个百年疾病，在中国具有庞大的患病人群，其分子机制相对明确而复杂，这为分子诊断带来了挑战，近年国内多种检测新方法的出现弥补了精准检测的空白，为FSHD病友带来了福音。本文将全面介绍这个特殊的疾病，并对相关基因检测技术进行对比，综合分析疾病诊断的准确性和经济效益，为FSHD患者获得精准诊断提供参考。

　　面肩肱型肌营养不良症（facioscapulohumeral musculardystrophy，FSHD）为成年人中最常见的肌营养不良症，其发病率居于神经肌肉系统疾病的第三位[PMID:20301616]，总发病率为1/5000～8000，属于常染色体显性遗传病。FSHD患者临床特征在于选择性的面肌、肩带肌和上臂肌受累，多数为非对称性，病情进展缓慢，临床表现具有很强的异质性，即使家族内成员，也可表现高度可变的临床表型，因此基因检测对患者的诊断至关重要。该病可影响患者生活质量，大约20％的超过50岁的FSHD患者丧失行走能力。

　　FSHD常染色体显性遗传模式图

　　FSHD分子遗传特征

　　大部分FSHD病例属于家族遗传，约1/3左右的病人表现为散发，为新发突变。FSHD患者在染色体4q35上具有D4Z4重复单元的数量缺失。正常人的等位基因上具有11~100个D4Z4重复单元，而FSHD患者只有1~10个，且在D4Z4最后的重复单元远端存在一个所谓4qA单体型结构，使得D4Z4区域中的DUX4蛋白得以表达而对肌肉产生毒性作用。D4Z4重复单元片段大小与临床表型之间呈负相关，重复单元片段越小，发病年龄越早，病情越严重。正常个体在10号染色体上也会携带4q35型D4Z4重复单元，或在染色体4q35上携带4q35-10q26型序列重组组成的D4Z4重复单元[PMID：20206332]。10号染色体上的D4Z4重复单元不致病，但染色体4q35上的杂交重复单元的缩短则可导致FSHD[PMID：20724583]。

　　FSHD的药物治疗前景

　　FSHD是有望应用药物治疗的一种罕见病，美国Acceleron药物公司开发的局部活性药物ACE-083旨在提高特定目标肌肉的力量和功能，以改善患者的功能和生活质量，目前在美国12个医院和加拿大2个医院进行药物第二阶段试验中。位于荷兰的FacioTherapies公司在2017年3月宣布已经验证了超过300种化合物，用于抑制DUX4蛋白的产生，目前尚处于实验室阶段。

　　FSHD分子诊断标准

　　完成FSHD的精准分子诊断，需要明确D4Z4的具体数量、染色体来源以及重组和嵌合现象，包括：

　　1.     需要明确D4Z4重复单元的准确数量。

　　2.     需要明确D4Z4致病单元来自于4号染色体，而不是10号染色体。

　　3.     需要明确D4Z4致病单元是4号染色体的4qA亚型，而不是4qB亚型。

　　4.     需要明确D4Z4重复单元数量是否为“零”。

　　5.     需要明确区分嵌合体突变和D4Z4重组突变。

　　FSHD分子诊断策略

　　在以往，FSHD的分子诊断主要依靠Southern Blot检测方法，近年出现的单分子FISH和Bionano SaphyrTM技术平台进一步弥补了精准分子诊断的空白。以下仅就以上几种方法，从检测原理、检测精度、结果准确性等方面进行阐释比较，以供临床选择更适宜的FSHD分子诊断方案。

　　1.    Southern Blot——FSHD基因诊断的标准方法

　　Southern Blot（SB）方法诊断FSHD已经有20多年的历史[PMID:9440803]，是FSHD分子诊断的标准方法 [PMID：22177830]。SB诊断方法采用限制性内切酶EcoRI 和EcoRI/BlnI（10q26的D4Z4重复单元被酶切成小片段而不可测得）酶切基因组DNA，再以p13E-11为探针（同位素标记）进行杂交。SB诊断方法可以解决90%左右的FSHD病人的分子诊断，但仍然存在一些不足，比如：

　　对DNA的质量要求高（约15ug的DNA）；

　　很难精确计算片段大小，难以辨别“灰色地带”的D4Z4重复单元数（10-11个）；

　　探针区域缺失时产生假阴性信号；

　　无法明确检测嵌合体的比例；

　　4q35和10q26重组的检测能力有限且对结果难以解释；

　　对单体型的辨别并非总是特异性的；

　　检测的条带需与分子大小的标记物和其他条带进行对比判读，主观性强；

　　步骤相对繁琐而耗时等。

　　Southern Blot——FSHD基因诊断的标准方法

　　2.    单分子FISH（Molecular Combing）——经过大规模临床验证的新的诊断“金标准”

　　单分子FISH，即分子梳技术（molecular combing，MC）是由法国Genomic Vision公司发明,目前该技术在中国的临床应用已独家授权广州嘉检医学检测有限公司。与SB检测方法不同的是，MC技术是基于固定在玻片上的经拉伸的单分子DNA的荧光原位杂交。通过这种方法，D4Z4片段被可视化并用不同的荧光标记探针确定片段大小，使得在单次检测中就能够区分4号染色体和10号染色体的来源，以及分辨4qA和4qB单倍型，并判断嵌合及重组状态。

　　单分子FISH一次检测可明确FSHD的五个分子诊断标准

　　Genomic Vision公司在2015年分析了MC（单分子FISH）相较于SB方法的优越性，在87个经SB技术诊断的疑似FSHD患者中71个为正常≥42kb；7个为重复单元缩短12~37kb；2个为边界值38-41kb；6个为解读不确定；1个为嵌合体。应用单分子FISH方法进行盲法验证，结果提示单分子FISH方法可以确证所有的SB检测阳性样本；2个处于边界值的样本经单分子FISH验证分别为阴性和“致病的”；6个不确定的样本分别鉴定为4个阴性，1个重组和1个边界值；约5%的SB检测正常样本，单分子FISH鉴定为重组或嵌合体或边界值 [PMID: 26420234]。 单分子的分辨率和可视化的结果可以精确计算D4Z4重复单元数量，由于每个样本都进行多次计数，且使用了内参校准，确保了计算结果的准确性。

　　实验证明该技术在FSHD诊断上具有显著优势，已经在国外有几千临床案例的验证，是国际对FSHD患者进行分子诊断的新“金标准”。

　　3.    Bionano SaphyrTM平台——FSHD分子检测的科研新平台

　　Bionano SaphyrTM平台是BionanoGenomics公司基于单分子光学图谱技术开发的遗传病检测平台。其基本技术流程包括从新鲜血液中抽提＞100kb的DNA分子，在特异性酶切位点进行荧光标记，并进行DNA分子的线性化处理。检测信号经数字化处理和DNA分子的从头（de novo）重新组装后与正常的基因组系列进行比对，从而分析获得DNA的变化特征。

　　BionanoSaphyrTM平台主要用于基因组的结构变异检测，善于检测长片段（达Mb水平）的纯合缺失/插入，在大的杂合缺失/插入检测中亦有不俗的表现，检测敏感性达87%，还可用于基因组序列的倒位、易位、重复、拷贝数变异等的检测，对基因组的组装具有明显的优势，广泛应用于动植物基因组的研究。在2017年美国人类遗传学学会的年会上，来自Bionano Genomics 公司的Dr. Jonathan Pevsner首次介绍了应用Bionano SaphyrTM平台对FSHD患者的临床诊断，不仅对4qA和4qB上的D4Z4重复单元数量进行了确定，同时可显著区分重复单元是来源于4号或10号染色体。希望该项技术能够走向成熟，跳出科研应用，尽早积累更多的临床数据以服务于FSHD病人的诊断。

　　虽然以上方法各有优势和不足，但在短时间内国内出现多种新方法对这个疾病进行检测，弥补了精准检测的空白，也为FSHD病友带来福音，根据有利病友原则，精确的临床分子诊断是对接后期药物研究，甚至是药物治疗的前提。综上所述，在选择检测方法的时候应从以病人为中心的临床适用性角度出发，综合分析疾病诊断的准确性和经济效益，才是FSHD患者获得精准诊断需要考虑的重点。