2.FcRn

与其他蛋白质或小分子相比，抗体之所以在体内有很长的半衰期，一个重要原因是能够和一种特殊的Fc受体FcRn结合。FcRn受体的结构与MHCclassI类似，由一条alpha链和beta微球蛋白构成。FcRn在体内有广泛的表达，包括许多组织的上皮，内皮细胞及多种免疫细胞（如单核巨噬细胞）等。FcRn与IgG的结合是pH依赖型的：只在弱酸性pH6.0左右结合，而在中性pH无结合。当血液中的游离抗体被细胞非特异的内吞至胞内体（endosome）中，由于胞内体内部pH为弱酸性（5~6），IgG通过抗体的Fc区与FcRn结合（图二）。结合后的抗体随FcRn转运至细胞膜表面，由于细胞外液pH为近中性（~7.4），此时IgG与FcRn失去结合，重新进入血液循环，从而延长了IgG在体内的半衰期。而其他不能和FcRn结合的蛋白，在胞内体内不能被FcRn回收，最终进入溶酶体降解，导致了较短的半衰期。除了IgG外，FcRn还同人的血清白蛋白（HSA）结合，其结合方式与IgG相同，也为pH依赖型，所以HSA在体内也具有和抗体相似的长半衰期（~20天）。化学小分子药物，如果能够结合HSA（比如疏水性较强），则其体内的半衰期也会显著延长。

如前面所述，IgG主要通过Fc区结合FcRn，但也有文献报道其Fab区域也可以和FcRn相互作用从而影响抗体的半衰期。Wang等人发现具有相同Fc区而不同Fab的IgG在pH6.0和7.3下对于FcRn的结合并不相同，揭示出抗体也一些情况下可以通过Fab区域与FcRn作用（DrugMetab Dispos 39:1469–1477）。作者随后发现不同抗体在pH6.0时与FcRn的亲和力与小鼠体内半衰期并无直接关系，然而在pH7.3下能够快速与FcRn解离的抗体则展示出更长的半衰期。因此即使具有相同骨架而不同CDR的抗体可能通过Fv区与FcRn的作用从而展现出不同的体内半衰期。

图二，FcRn对抗体的循环（图片来源：https://absoluteantibody.com/antibody-resources/antibody-overview/other-antibody-interactions/）

3.等电点

多数处于临床前开发的抗体的等电点在碱性区间（>7.0）。在抗体的生产及储存过程中可能会产生多种电荷异构体，主要来源包括天冬酰胺脱酰胺、N端谷氨酰胺环化、重链末端脱赖氨酸等等。抗体的等电点越高，则在体内近中性pH下会带更多的正电荷。由于细胞膜及组成细胞外基质的许多糖蛋白带负电性，研究表明高等电点的抗体更容易吸附于组织细胞上，表现为更快的组织清除和较短的半衰期。例如Igawa等人在2010年的工作中对IL6R的抗体可变区进行修改，产生了多个等电点的针对同一抗原的抗体（ProteinEng Des Sel23:385–392）。这些抗体在pH6.0条件下显示出对FcRn相近的亲和力，但是小鼠体内实验发现抗体等电点的升高与体内清除成正相关，并伴随着半衰期的显著降低（图三）。因此，合适的等电点是一个抗体可开发性的一个重要评判标准，理想的情况是在8~9左右。处于这个区间的抗体在血液pH7.4的环境下带正电，通过电荷排斥减少聚集体的发生。同时较少的正电会减少组织细胞对抗体的清除，延长其在体内的半衰期。

图三，抗体pI与半衰期及体内清除的关系（图片来源：ProteinEng Des Sel 23:385–392）

4.糖基化

位于IgG1中CH2结构域的天冬酰胺297是抗体的一个保守的糖基化位点。但是对于某些抗体，在可变区内也可以出现糖基化，如在cetuximab重链可变区88位置的天冬酰胺。除了上述提到的N糖基化，在一些Fc融合蛋白中，与Fc融合的蛋白部分（很多情况是胞外蛋白结构域）也可能存在N或O糖基化现象。抗体与FcRn的相互作用并不受N297的糖基化影响，因此许多工作表明无糖基化的抗体与野生抗体相比在体内有类似的长半衰期。但是在一些情况下，糖基化可以通过影响抗体的体内清除从而影响其半衰期。例如高甘露糖的抗体显示出较快的血清清除，这是由于肝细胞及位于肝脏内的血管内皮细胞，吞噬细胞等表达甘露糖受体，能够特异的将高甘露糖的蛋白通过结合并内吞的方式从血液中清除。与高岩藻糖增加抗体的血浆清除相对，一些工作表明高唾液酸通常有利于提高抗体的体内半衰期，这也许与其带有较高的负电荷有关。

5.靶点介导的清除

上面提到的分子量、与FcRn作用、等电点和糖基化都是在讨论抗体本身的结构组成及物理化学性质对其药代动力学的影响。而体内游离的抗体一旦结合相对应的抗原，抗体的药代动力学就要随之受到抗原的影响。如果游离抗原自身的体内清除较快，则与之紧密结合的抗体的半衰期也会随之下降。如Brenner等人的工作显示针对结缔组织生长因子（CTFG）的抗体FG-3019有很快的体内清除，原因是其针对的抗原CTFG自身会被肝脏快速清除（PharmRes33:1833–1849）。另一种抗原介导的抗体清除机制多见于膜蛋白靶点。当抗体与这些膜蛋白结合后，引起的二聚或多聚化会导致膜表面受体的内吞，最后通过胞内体endosome转运至溶酶体中进行降解。抗体一旦与抗原紧密结合，在胞内体中就无法通过FcRn的途径循环到细胞表面了。现在治疗抗体的一个重要分支抗体毒素复合物ADC正式利用了膜表面抗原的内吞从而将抗体运送至溶酶体中并释放与之相连的毒素从而杀伤肿瘤细胞。这里要提到的由于体内抗原的数量是有限的，因此靶点介导的抗体清除存在饱和性，对抗体药代动力学的影响是非线性的。当抗体的体内浓度很低时，抗原相对抗体过量，靶点介导的清除起显著作用。但随着抗体的体内给药浓度的升高，抗原逐渐饱和，或者内吞的抗原导致表面靶点数量减少，而此时新的抗原还未及时通过蛋白合成途径补充。这些情况下，靶点介导的抗体清除就会显著减少。因此用数学模型描述靶点介导的清除时需要考虑靶点本身的生物学特征。

6. 抗药物抗体

当治疗抗体由于序列或聚集体等因素存在免疫原性时，注射后人体内会产生针对治疗抗体的特异性清除抗体，或称为抗药物抗体（anti-drugantibody，ADA）。目前抗体的序列来源主要有两类：一类是通过人源化改造鼠源或骆驼源的抗体得到的人源化抗体；另一类是通过人噬菌体库或转基因小鼠得到的全人序列抗体。目前为止，并没有直接证据证实全人序列抗体比人源化抗体具有更低的免疫原性。例如针对TNF的Humira是全人序列的抗体，但多项研究表明根据疾病及疗法的不同Humira在5%~89%的临床病人中均会诱导产生抗药物抗体从而降低其疗效。由于ADA是人体针对治疗抗体的特异免疫反应，所以通常单次注射具有免疫原性的抗体后两至三周才会产生ADA。很多情况ADA针对的是治疗抗体的可变区，因此ADA可以直接阻断治疗抗体对靶点的结合，并且所形成的抗体-ADA免疫复合物会被机体快速清除。因此抗体的血液浓度会随着ADA的产生而显著下降（图四）。另外需要提到的是抗体在临床前动物模型中的免疫原性并不能很好的预测该抗体在人体内诱导ADA的能力。抗体在猴子以及病人中产生ADA的案例中只有不到60%的相关性（MAbs5:810–816），例如PD-1抗体Keytruda在猴子中有比较强的免疫原性，但是临床中表明只有不到2%的病人内产生ADA，并且产生的ADA并不影响Keytruda的体内药代。

图四，ADA对抗体血药浓度的影响（图片来源：ProteinCell 2018, 9(1):15–32）

上面阐述了了影响抗体药代的几个因素，下面简单归纳一下提高抗体及治疗蛋白的体内半衰期的一些方法。首先，对于分子量比较小的抗体片段或治疗蛋白容易通过肾小球过滤清除，可以通过偶联聚乙二醇（PEG）的方法提高蛋白自身的分子量。除了直接增加分子量，PEG还会减少蛋白与吞噬细胞如巨噬细胞的相互作用，较少内吞介导的体内清除。但是一个要注意的地方是PEG也可能会屏蔽或阻挡抗体的抗原结合位点，降低抗体或治疗蛋白的药效，因此选择合适PEG的长度，类型与偶联位点至关重要。另一种做法是将治疗蛋白直接与抗体Fc区或者人血清白蛋白HSA相连成融合蛋白。这样不仅直接提高分子量，同时融合蛋白还获得了与FcRnpH依赖的结合能力，进一步提高体内半衰期。由于FcRn与Fc的结合pH在6左右，因此可以通过抗体工程的方法选择性地提高抗体在pH6.0时对FcRn的亲和力同时维持在pH7.4时抗体与FcRn不结合。现在有许多氨基酸定点突变如M252Y/S254T/T256E及H433K/N434F等都在动物模型中证实可以显著提高抗体半衰期。对于等电点比较高的抗体可以通过蛋白工程的方法在特殊位点引入负电氨基酸或者移除正电氨基酸达到降低等电点的目的。如果靶点介导的抗体清除作用明显，可以通过抗体工程化的方法将抗体与抗原的结合改为pH依赖型。在血液pH下抗体结合抗原，行成免疫复合物，被吞噬细胞内吞。进入到细胞内体后，pH降低，抗体与靶点解离，利用FcRn重新循环到细胞表面后释放到血液中；而解离后的靶点通常会运送至溶酶体降解（图五）。这种类型的抗体能够有效降低靶点介导的清除从而延长体内的半衰期，同时增加其疗效。对于糖型不理想的抗体（如含有高甘露糖）可以通过改造细胞株，优化细胞培养工艺对糖基化类型进行改进。最后，对于高免疫原性的抗体可以通过T细胞表位预测的方法降低抗体的免疫原性，从而减少抗药物抗体产生的几率。

图五，pH依赖型的抗原结合抗体（图片来源：Molecular Immunology, Volume 67,Issue 2, Part A, October 2015, Pages 131-141）

总结

作为药代动力学的一个重要参数，抗体的半衰期综合体现了抗体在体内吸收，分布与吸收的过程。提高半衰期可以有效提高抗体的药效，减少给药剂量与频率，降低可能的副作用，降低病人的治疗负担。随着抗体技术日新月异的发展，出现了抗体片段，双特异抗体，抗体毒素偶联物ADC等不同形式的抗体衍生物等，其药代动力学也比传统抗体变得更加复杂。本文阐述了一些影响抗体半衰期的因素包括分子量、FcRn结合、等电点、糖基化、靶点介导的清除及抗药物抗体，同时简单探讨了提高治疗抗体体内半衰期的常用手段。介于笔者阅历与知识有限，疏漏或不足之处还敬请各位同仁指教。最后十分感谢抗体工业界的大咖邓俗俊老师抽出百忙时间对本文的审阅并提出宝贵的意见。

参考文献：

1: Drug Metab Dispos 39:1469–1477

2: Protein Eng Des Sel 23:385–392

3: Pharm Res 33:1833–1849

4: MAbs 5:810–816

5: Protein Cell 2018, 9(1):15–32

6: Advances in Bioscience and Biotechnology, 2013, 4, 689-698

7: Molecular Immunology, 2015, 67(2), Part A, 131-141

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