胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）

RIPA磷酸（酯）酶抑制剂

激活的Na3VO4（用H2O配制成200 mM 的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protocol）

NaF（200 mM 的储存液，室温保存）

注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制：

配制100 ml 的modified RIPA buffe：

1. 称取790 mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900 mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4。

2. 加10 ml 10%的NP-40 。

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 。

4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存 。

5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100 μl； PMSF， Na3VO4， NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度：

Tris-HCl： 50 mM， pH 7.4

NP-40： 1%

去氧胆酸钠：0.25%

NaCl： 150 mM

EDTA： 1 mM

PMSF： 1 mM

抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂： 各1 μg/ml

Na3VO4： 1 mM

NaF： 1 mM

免疫共沉淀技术路线

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。

2. 加入预冷的RIPA Buffer（1 ml/107个细胞、10 cm 培养皿或150 cm2 培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm 培养皿、75 cm2 培养瓶）。

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5 ml EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）。

4. 4℃，14000 g 离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。

5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

6. 每1 ml 总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子。

8. （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。

9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）。

10. 加入一定体积的兔抗到500 μl 总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异。

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2 h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育。

12. 加入100 μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1 h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）。

13. 14000 rpm 瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800 μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS。

14. 用60 μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl 足够上三道）。

15. 将上样样品煮5 min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5 min 变性。

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