双缩脲法测定蛋白质含量实验报告(八篇) |
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实验十二 双缩脲法测蛋白质含量 【目的和要求】 掌握双缩脲法定量测写蛋白质含量的原理和方法。 【原理】 蛋白质含有两个以上的肽键,因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与C u2+形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子在一定的实验条件下,未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于量及氨基酸成分无关,因此被广泛地应用。 540~560nm下比色,可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。标准蛋白质溶液可以用结晶的牛(或人)血清清蛋白、卵清蛋白或粉末配制。 除—CONH—有此反应外,—CONH2,—CH2—NH2,—CS—NH2等基团亦有此反应。 血清总蛋白含量关系到血液与组织间水分的分布情况,在机体脱水的情况下,血清总蛋白质含量升高,而在机体发生水肿时,血清蛋白含量下降,所以测定血清蛋白质含量具有临床意义。 【操作方法】 一、绘制标准曲线(学生自己列表,依次加入溶液) 取一系列试管,分别加入0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0ml的标准酪蛋白溶液(作为标准用的应当用凯氏定氮法测定蛋白氮含量,以确定酪蛋白的纯度),用水补足到2ml,然后加入4ml双缩脲试剂在室温下(15℃~25℃)放置30min,于540nm波长下用72型分光光度计比色测定。最后以光密度为纵坐标,酪蛋白的含量为横坐标绘制标准曲线,作为定量的依据。 二、未知样品蛋白质浓度的测定 未知样品必须进行稀释调整,使2ml中含有1~10mg蛋白质,才能进行测定。 吸取1ml 1:10稀释的血清待测液,用水补足到2ml。操作同前,平行做两份。 与标准曲线的各管同时比色。比色后从标准曲线上查出其蛋白质浓度,再按照稀释倍数求出每毫升血清原液的蛋白质含量。 【试剂和器材】 一、试剂 (1)标准酪蛋白溶液(5mg/ml):用0.05N氢氧化钠配制。 (2)双缩脲试剂:溶解1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠 …… …… 余下全文 |
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