相分离（phase separation）一词，指的是自然界中混合的两种液体出现相互分离的现象，最初主要被用于物理化学研究领域。近几年，随着多项生物细胞内相分离的研究结果相继发表在Science、Nature、Cell等顶级期刊，彻底引爆了研究者们对于这一生物学现象的研究热情。在生物学范畴，相分离的提出，彻底打破了人们对于细胞内亚细胞器的传统认识。现有的研究结果指出，包括核仁、卡哈尔体、应激颗粒在内的许多无膜细胞器的形成都是由相分离介导的。除此之外，相分离介导的胞质和核内凝聚体的形成，被证实与肿瘤以及神经退行性疾病等疾病的发生发展密不可分。

相分离的出现，为细胞生物学的研究提供了一个更高的维度，更强调某些时空特异性的生物调节机制。比如应激颗粒（stress granule), 在细胞受到胁迫条件下产生，有利于解除胁迫后的细胞快速恢复常态；再比如细胞核内促进rRNA加工的核仁，某些转录调控的超级增强子，异染色质等也都被报道形成相分离结构。此外，有研究报道，RNA干涉，纺锤体形成，先天免疫应答等过程也存在着相分离。基于此，本文作者大胆猜测，既然相分离广泛地调控各种生物学过程，那么，其是否也在此过程中影响了某些特定药物的疗效及其耐药性的产生；为此，作者挑选了数个临床上广泛应用的抗肿瘤小分子药物，对其进行了荧光标记以及和不同凝聚体的共定位。通过一系列实验验证，作者最终提出，以顺铂、他莫昔芬为代表的抗肿瘤小分子药物由于自身特殊的物理化学性质，被选择性地富集到特定核内凝聚体中，并且，这种药物动力学过程对于此类小分子药效的发挥起着决定性作用。

知识点积累

目前研究相分离的常用实验手段：1.光漂白荧光恢复技术（FRAP，fluorescence recoveryafter photobleaching），看目标蛋白是否在短时间内恢复荧光。这可以表明此种结构是否与周围环境在进行频繁的物质交换；2. 结构大小是否达到或接近微米级别；3.活细胞成像，是否能观察到液滴融合或分离现象；4. 体外重构。利用纯化的蛋白，在生理相关的条件下是否可以重构出相分离结构。这也是确定相分离机制的有效手段。

光漂白荧光恢复技术：是用荧光物质标记细胞膜蛋白或膜脂质，然后以一束激光照射细胞膜,使某一部分的荧光漂白。如果膜蛋白是流动的,当停止激光照射后，漂白部位的荧光又可恢复，根据其恢复速度可以计算出膜蛋白或膜脂质的扩散速率。

实验结果

1.人体组织中和体外细胞中核凝聚体的分布现有的研究指出，细胞核内凝聚体在许多细胞系中广泛存在，并且其中包含了一些特定的蛋白，这类蛋白不仅可以作为支架蛋白促进凝聚体的形成，同时也是指示这些凝聚体形成的标志物。比如在超级增强子介导的转录增强复合物中，转录辅激活因子MED1和BRD4就同时扮演着上述两种角色；另外，剪切体斑点、异染色质和核仁凝聚体中，则分别由SRSF2、HP1⍺、FIB1 和 NPM1 等蛋白进行指示。基于此，本文作者首先对乳腺癌和正常乳腺以及结肠癌和正常结肠组织的活检标本进行了核内凝聚体的检测。实验结果显示，不管是在癌变组织中还是正常组织中，均呈现出核内凝聚体的广泛分布，并且，其在二者之间的分布并没有显著差异（Fig.1B、1C）。基于上述结果，作者决定进一步地通过体外重构凝聚体的方式，对小分子在这些液滴中的分布进行探讨。按照Fig.1D所示的实验流程，作者首先对两种荧光小分子（荧光素和Hoechst染料）以及荧光标记的右旋糖酐在核内凝聚体中的分布进行了检测。结果显示，荧光素等小分子在整个细胞中均匀分布（Fig.1E）。虽然，荧光素和MED1、BRD4等核内凝聚体存在共定位，但此类小分子并没有在核内凝聚体中富集，而是以自由扩散的方式进出凝聚体（Fig.1A、1E）。

2.体外液滴实验探索小分子药物在核凝聚体中的分布模式既然荧光素等小分子可以自由扩散进出MED1、BRD4等介导形成的核内凝聚体，那么，其他一些已知作用靶点就在核内的抗肿瘤小分子（顺铂和米托蒽醌）似乎应该也顺理成章以同样的方式在凝聚体内外自由扩散。对此，作者还是进行了实验验证。但是，令人惊奇的是，顺铂和米托蒽醌分别选择性地在MED1和MED1、FIB1以及NPM1中富集（Fig.2A、2B）。此外，为了排除由于荧光标记使顺铂特异性地在MED1中富集，作者采用了未修饰的顺铂进行竞争实验，结果显示，顺铂可以使荧光标记的药物排出凝聚体中，但顺铂的异构体（Transplatin）则无此效果，说明了进入MED1凝聚体的确是顺铂分子本身的理化性质所决定的（Fig.S7B-7D）。先前的研究证实了米托蒽醌具有进入核仁的能力，而本研究中，米托蒽醌的确在核仁中FIB1和NPM1凝聚体中聚集，说明米托蒽醌和顺铂一样，在MED1凝聚体中的聚集是靶标非依赖性的（Fig.2B）。进一步地，作者挑选了数个靶向调节转录活性的小分子抗肿瘤药物（他莫昔芬、CDK7抑制剂THZ1以及BRD4抑制剂JQ-1）进行上述实验。实验结果显示，这几个小分子同样选择性地在MED1凝聚体中富集（Fig.2C-E）。由此，作者再次地验证了小分子药物的确有选择性地在特定核内凝聚体中富集。为了对这类小分子进出凝聚体的动力学过程进行探讨，作者采用了光漂白荧光恢复实验验证了顺铂在此类凝聚体中是处于高度动态的流动体形式（Fig.S12A-B）。

3.小分子药物在凝聚体中的浓度影响其药理活性既然小分子会在特定凝聚体中富集，那么这一过程是否会影响小分子的靶向性和药物动力学性质呢。于是，作者选择了对顺铂的DNA铂化修饰作用进行了检测。实验结果如Fig.3A-3B所示，荧光标记的顺铂和MED1凝聚体以及DNA发生共定位，但无法和HP1α共定位。同时，顺铂剂量依赖性地诱导MED1凝聚体中的DNA发生铂化，但对HP1α凝聚体的效果则十分微弱（Fig.3B）。此外，肿瘤细胞HCT116中进行免疫荧光共定位实验，同样证实了铂化的DNA更多地是存在与MED1凝聚体中，而非HP1α和FIB1中（Fig.3C）。考虑到顺铂进入细胞核内是其发挥抗肿瘤活性的必要条件，那么铂化DNA进入MED1凝聚体又有何种生物学功能呢。通过检测，作者发现顺铂选择性地抑制HCT116细胞中MED1凝聚体的形成（Fig.3D）。进一步的ChIP-seq实验，证实了顺铂处理导致MED1和超级增强子的结合减弱，但不影响MED1与普通增强子的结合（Fig.3E）。高通量测序的结果，同样证实了铂化DNA主要分布在超级增强子上，而非普通增强子（Fig.3F）。

4.MED1凝聚体中他莫昔芬的作用和耐药性的产生

在此前研究中，有研究者报道了ERα作为一个经典的核受体，以雌激素依赖性方式整合到MED1凝聚物中。而他莫昔芬是临床上广泛使用的雌激素拮抗剂，其耐药性的产生往往伴随着ERα突变导致的ER再活化。基于此，作者进一步猜想ERα活化导致的他莫昔芬耐药性是否有可能是MED1介导的（Fig.4A）。通过体外液滴实验，作者发现他莫昔芬只能削弱野生型的ERα进入到MED1凝聚体中，而无法抑制突变体进入到MED1中。通过对他莫昔芬敏感以及耐药细胞株的检测，作者证实了在他莫昔芬耐药株中，MED1凝聚体的体积要明显增大（Fig.4C）；进一步地通过对不同体积的MED1凝聚体进行他莫昔芬敏感性检测，结果证实了他莫昔芬有效降低ERα进入到体积较小的MED1凝聚体中，而对大体积的MED1中ERα的富集则没有抑制效果（Fig.4D）。同样地，作者对荧光标记他莫昔芬（FLTX1）进行了MED1共定位实验。结果显示，FLTX1在小体积MED1凝聚体中被有效富集，但在大体积MED1凝聚体中的浓度则显著低于小体积MED1中（Fig.4E）。基于上述实验结果，作者证实了他莫昔芬类药物抑制ERα的机理可能是通过降低ERα在MED1凝聚体中的富集，而在其耐药过程中，MED1过表达会促进ERα在MED1凝聚体中的富集，从而削弱他莫昔芬对ERα的抑制作用；与此同时，ERα发生突变后，他莫昔芬对其的抑制能力进一步削弱，ERα在MED1凝聚体中富集程度进一步升高，加速了他莫昔芬耐药性的产生（Fig.4F）。

总结与思考

相分离是近年生物学研究领域中的一大热点，有关相分离的重磅研究近年来可谓层出不穷。总得来说，现有研究对于相分离的结构及其与特定疾病的相关性已有了一定程度的了解，但目前尚未有研究涉及将相分离用于临床诊断和治疗。本文的研究方向和研究内容，对相分离的实际应用开发具有启示意义。本研究结果发现了，人体细胞核中有许多相分离的浓缩颗粒（凝聚体），而这些凝聚体具有分隔并富集特殊小分子药物的能力。小分子被选择性地分隔到与其药理靶标无关的凝聚体中，会导致其药物动力学的改变以及肿瘤耐药性的产生。

总的来说，本文首次提出相分离凝聚体在作为药物靶点中的全新作用，对于肿瘤、神经退行性疾病等相分离相关疾病的治疗革新均有积极的推动意义。本文的通讯作者是来及怀特黑德生物医学研究所的Richard A. Young教授—超级增强子的发现者。另外，共同作者还有来自哈佛大学医学院大名鼎鼎的Nathanael Gray。本项研究可谓是强强联合，汇聚了多个领域内的顶尖大牛。然而，在本文发出后，很快引起了各方研究人员的强烈关注，其中不乏质疑之声。一些研究人员对Young教授的本项工作的临床意义表示怀疑，认为本项研究目前更多地仍处在“实验室阶段”，过分高估本项研究的发现着实不妥。此外，纽约理工大学Navin Pokala教授更是直白地指出，本文采用的顺铂、他莫昔芬均不溶于水，因此，不能均匀分布在细胞内，而是进入特定凝聚体一点也不足为奇，并认为这是一个“trivial artifact”。就笔者本人个人观点而言，的确，上述的质疑并非空穴来风。从药物理化性质来看，Young教授貌似有偏向性地选择了较多的脂溶性药物。并且在荧光素的选择方面，作者采用的都是强水溶性的分子，因此，有可能导致荧光标记分子具有两亲性，继而使其堆积形成类似脂质体甚至纳米粒的分子材料，从而使其容易进入到隔离的凝聚体中。不过，本文在MED1凝聚体介导他莫昔芬敏感性方面的研究，本人认为是十分solid，临床意义重大的，并且和临床实际结果是一致的。

引用“SCI文摘”