脱水顾名思义就是脱去组织中的水分，其能使组织结构变得更加坚固，以防后期操作造成组织变形或破坏，这是影响石蜡切片质量的关键一步，脱水若不彻底则会影响浸蜡和染色，但若脱水过度则会使组织变脆易碎。通常采用从低浓度到高浓度的梯度酒精进行脱水操作。如：75%酒精4h，85%酒精2h，90%酒精2h，95%酒精1h，无水乙醇Ⅰ0.5h，无水乙醇Ⅱ0.5h。同样，脱水的时间及酒精梯度的设置可先根据经验值进行设定，后续再视实际情况进行轻微调整。

3.透明

透明可按照无水乙醇+二甲苯（1:1）10 min，二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min的顺序进行。同样，透明过程并不一定要严格按照上述操作进行，查阅资料就会发现有的地方直接采用二甲苯进行透明，有的则认为二甲苯极易挥发并不适合直接进行透明，所以与无水乙醇混合后再进行透明。此外，无水乙醇与二甲苯的混合比例也是各有不同，有的地方也会为其混合比例设置梯度，如：2/3无水乙醇+1/3二甲苯进行第一次操作，无水乙醇：二甲苯=1:1进行二次操作，1/3无水乙醇+2/3二甲苯进行三次操作等，处理时间上也是各有不同。

4.浸蜡

浸蜡主要是使石蜡进入组织，从而对组织起一定的支撑作用。一般石蜡熔点为56℃~58℃，所以浸蜡温度最好控制在其附近（不同石蜡的熔点略有差异）。为使浸蜡充分，一般也需要操作三次，如：石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各1h。

5.包埋

浸蜡结束后，将组织放入包埋盒中，加入熔化的石蜡，小心将其置于冷台上待其冷却凝固即可（注：取放组织时一定要注意格外小心，以免引起组织变形、折叠或损坏；若为小体积样本则需格外谨慎，以免因失误造成组织丢失；包埋盒的大小也要根据组织的大小和形状进行选择；此外还需注意组织摆放的方位）。

6.切片及展片

切片前，先将蜡块预冷片刻以便于切片。先将切片机调整至较厚的厚度（如：7 μm）进行修片（注：修片后再进行切片时最好换一下刀的位置，刀钝的情况下很容易破坏组织，镜下能看到明显的刀痕），待能看到组织后，将切片机厚度调整至3 μm（石蜡切片常用厚度），以能够切出完整连续的组织片为宜。用毛刷轻轻沾取切好的片子后，先将其置于冷水中进行展片，而后将其转移至42℃左右的温水中进行二次展片，以使组织平整展开，尽可能避免出现褶皱。

7.捞片及烤片

用镊子轻轻拨去多余的组织片，并用报纸或其他较硬的纸轻轻带去水面上的碎片后开始捞片。拿出载玻片，用拇指和食指固定载玻片两侧面，并用中指辅助抵住载玻片背面以固定载玻片（注：分清载玻片正反面，有磨砂面的一面为正面，便于标记，另一面则为反面，是光滑的），将载玻片以大约45°角（视个人习惯而定，不要使组织出现褶皱即可）斜插入水面中，缓缓靠近组织片，待组织片一边接触到载玻片时顺势将载玻片提起即可完成捞片。捞片结束后，将片子置于60℃左右的烤片机上烤片1h即可（注：时间太短可能会脱片，而时间太长也会破坏组织）。至此，石蜡切片制作完毕。

8.脱蜡复水

按照二甲苯Ⅰ（10 min），二甲苯Ⅱ（10 min），二甲苯Ⅲ（10 min），无水乙醇Ⅰ（5 min），无水乙醇Ⅱ（5 min），95%酒精（3 min），90%酒精（3 min），80%酒精（2 min），70%酒精（2 min），蒸馏水Ⅰ（3 min），蒸馏水Ⅱ（3 min）的顺序完成组织的脱蜡复水（注：操作流程并不固定，根据自己的组织适当调整即可）。

9.抗原修复

配制柠檬酸盐抗原修复液（PH6.0），采用微波炉进行抗原修复，首先中高火（80%火力）8 min，然后停火8 min，最后中低火（50%火力）7 min，待其自然冷却后，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。

10.封闭

清洗完毕，轻轻吸干水分，用组化笔在组织周围画圈，圈住整个组织，而后滴加山羊血清室温封闭1h，封闭结束后，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。

11.一抗孵育

滴加一抗以覆盖整个组织为宜，4℃，孵育过夜。孵育结束，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。

12.二抗孵育

滴加荧光二抗以覆盖整个组织为宜，放入暗盒内避光室温孵育1h（注：此后所有步骤均需避光操作），孵育结束，用PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min。

13.DAPI染色

采用DAPI染液室温避光染色10 min，用PBS洗涤3次，每次5 min。轻轻蘸干水分，滴加抗荧光衰减封片剂，盖上盖玻片。

14.观察

在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察目的蛋白的分布情况。

（图片来源：https://doi.org/10.3389/fnana.2020.582218）

本文作者是"夏沫梦鸢"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。

文稿：夏沫梦鸢

校对：煲仔饭

素材：Canva

参考资料：

https://images.app.goo.gl/9gWRdWskyz7UHV6G6

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnana.2020.582218/full

https://images.app.goo.gl/9gWRdWskyz7UHV6G6

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnana.2020.582218/full返回搜狐，查看更多