PCR异常扩增曲线分析攻略 |
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PCR异常扩增曲线分析攻略
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耗材对于荧光定量PCR来说比较重要，很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。常见的耗材相关问题包括： 1）错误使用成普通PCR仪器所对应的耗材 普通PCR耗材一般透光度比较差，会造成荧光扩增曲线异常，比如打折的扩增曲线（图三）。   图三：错误使用普通PCR耗材的结果 2）未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材 荧光定量PCR 仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种，如果0.1ml加热模块用成0.2ml耗材，则会造成耗材压扁，甚至造成机器故障；如果0.2ml加热模块用成0.1ml耗材，则会造成反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触，从而出现热传导不充分，进而影响酶的活性，会引起重复性不好（图四），或者溶解曲线多峰（非特异扩增），甚至是假阴性结果； 3）使用了质量比较差的耗材 目前市面上荧光定量PCR耗材种类繁多，质量也是良莠不齐，在耗材选择上尽量选择质量、品牌好一点的，否则会引起一系列问题，造成不必要的浪费。 比如质量不好的耗材可能会引起荧光值不稳定，这会造成反应孔的自动基线扣除错误，得到不准确的CT值（图五左图），更换质量好的耗材后，荧光信号正常（图五右图）；   图五：质量不好的耗材引起荧光值不稳定图（上） 如果使用的PCR反应板封膜质量不好，在PCR过程中受到水蒸气的影响，容易产生变形（图六），这样会引起“optical warping”，即“光学扭曲”现象（图七 左图），该实验中由于使用了ROX作为参比染料，ROX有效的校正了这种荧光信号的变化，均一化的扩增图结果是正常的。图六：PCR过程中水蒸气使得封膜变形   图七：光学扭曲结果图及ROX均一化结果图 除了耗材外，跟仪器配套使用的配件也要检查是否使用正确，比如配套的8联管托架，在使用的时候只用托架的下半部分，如果忘记把上半部分取下，有可能会影响扩增（图八）。  图八：未将托架上半部分取下，造成有些靶标未扩增 |
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