各位大神，本人新手一枚，最近在做RealTime pcr 遇到些问题：1.熔解曲线上升的峰比较缓慢，不像别人文章里那样一下就上升，请问如何优化?对实验结果有何影响?2.熔解曲线前有引物二聚体的小峰，除了引物浓度梯度以外，还有什么优化方式（用的Mix，不能优化镁离子……），如果实在不能优化，少量的引物二聚体对实验结果有影响吗?3.如果相对定量的结果和标准曲线没有关系（此处认为标准曲线的意义在于证明该体系可以稳定进行 所以做标准曲线） 那么我的跑样结果中的熔解曲线图还重要么?是否也要求像标准曲线一般良好?

你的扩增曲线是什么样子的?用的是染料法吗?感觉你引物的特异性不是很好，Tm值是多少?我们一般优化峰型会用热启动dNTPs。因为你用的是Mix，所以可以调整的余地就很小了

@2楼:你的扩增曲线是什么样子的?用的是染料法吗?感觉你引物的特异性不是很好，Tm值是多少?我们一般优化峰型会用热启动dNTPs。因为你用的是Mix，所以可以调整的余地就很小了 但是跑胶看确实没有引物二聚体，况且如果有，也应该是一个小峰，我这个没有小峰，而是在75-80度缓慢上升形成峰…不知道怎么解释

@3楼:但是跑胶看确实没有引物二聚体，况且如果有，也应该是一个小峰，我这个没有小峰，而是在75-80度缓慢上升形成峰…不知道怎么解释... 没有图让大家怎么解答，你的描述不一定准确的，会遗漏很多...

不知道你的PCR产物有没有测过序，确定是你要的目的片段吗?今天在一本指南中看到了一个例子，溶解曲线有个峰型跟你描述的很像，不过是个非特异性产物的峰。我传到附件中了，你可以看一下。溶解曲线图.docx398.66 K

@5楼:不知道你的PCR产物有没有测过序，确定是你要的目的片段吗?今天在一本指南中看到了一个例子，溶解曲线有个峰型跟你描述的很像，不过是个非特异性产物的峰。我传到附件中了，你可以看一下。 我看了一下，不太一样呢，我把图传上来，麻烦您帮我看下呗……

这是我的图，电泳显示只有一条带。但是这个图实在是理解不能啊

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@4楼:没有图让大家怎么解答，你的描述不一定准确的，会遗漏很多..... 好的好的 我把图传上来了~~~

你扩增的目的片段是不是很小?如果太小不容易与引物二聚体分开。看你这个峰值对应的温度比较低。你最好是测序确认一下你的目的产物。或者是换引物。还有你说的引物二聚体的小峰那个应该不是引物二聚体。跑电泳显示只有一条带不一定就代表没有非特异性的扩增，因为有些非特异性扩增的条带跟你的特异性产物大小很接近，跑电泳根本看不出来。你的反应条件是怎样的?退火温度有多少?退火温度不能太低了，或者是你换一下热启动酶试试，看能否提高特异性。

@9楼:你扩增的目的片段是不是很小?如果太小不容易与引物二聚体分开。看你这个峰值对应的温度比较低。你最好是测序确认一下你的目的产物。或者是换引物。还有你说的引物二聚体的小峰那个应该不是引物二聚体。跑电泳 ... 果然一语中的T-T 就是只有160bp左右，今天换了3步法，依然这样，所以打算换引物了 ╮(╯-╰)╭  不做无谓的挣扎了谢谢您的回答哈

160bp不小啊，在推荐范围内，你还是直接换引物吧，以免浪费时间

@11楼:160bp不小啊，在推荐范围内，你还是直接换引物吧，以免浪费时间 我今天做了另外一个基因，唯一的问题就是熔解温度在76度，不知道这样的结果可信吗 难道是引物二聚体吗

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@3楼:但是跑胶看确实没有引物二聚体，况且如果有，也应该是一个小峰，我这个没有小峰，而是在75-80度缓慢上升形成峰…不知道怎么解释... 你好，我想问下你的问题解决没呀。我的有一个基因的熔解曲线的峰值在78。这种情况确定是引物二聚体吗?