分子生物学 |
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基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的核酸序列经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程 基因表达包括: ①基因经转录、翻译产生有生物活性的蛋白质的过程 ②rRNA或tRNA的基因经转录和加工产生成熟的rRNA或tRNA的过程 原核生物基因表达调控的层次 DNA水平的调控:通过DNA重排等机制来调节基因表达。如沙门氏菌鞭毛蛋白的相变等。 转录水平的调控:调控DNA模板上转录特异mRNA的速度。这是生物在进化过程中选择的最经济的调控方式。 翻译水平的调控:mRNA合成后,通过控制多肽链的形成速度实现调控。 原核中,操纵子是调控表达的基本单位,调控主要在转录水平;真核的调控层次更多。 1、基因表达的特异性基因表达是受到严格调控的,通常各组织细胞只合成其自身结构和功能所需的蛋白质。人有2万多个基因,基因表达有高度的时空特异性。只有部分基因在特定的细胞或在特定的发育时期才表达,其它基因却处于关闭状态。如果基因表达调控发生变化,细胞的形态与功能也会随之改变;如正常组织细胞转化为癌细胞的过程与基因表达改变有关。 1)基因表达的组织特异性(tissue specificity):不同组织细胞中基因表达的数量、强度和种类各不相同。细胞特定的基因表达状态,就决定了这个组织细胞特有的形态和功能。 2)基因表达的阶段特异性(stage specificity):细胞分化发育的不同时期,基因表达也不相同。一个受精卵含有发育成一个成熟个体的全部遗传信息,在个体发育分化的各个阶段,各种基因极为有序地表达。 2、基因表达适应环境的变化生物只有适应环境才能生存。当环境条件变化时,生物体就要改变自身基因表达状况,以调整体内执行相应功能蛋白质的种类和数量,从而改变自身的代谢、活动等以适应环境。 细胞中有些蛋白质的数量几乎不受环境变化影响,称为组成性蛋白;如糖酵解中的酶蛋白。随环境变化而变化的蛋白为适应性蛋白。这是由基因表达调控的。 1)组成性表达(constitutive expression):指不大受环境变化而变化的一类基因表达。 组成性表达的产物组成性蛋白,是细胞或生物体整个生命过程中必不可少的,这类基因可称为看家基因(housekeeping gene)。基因表达几乎不受环境影响的原因可能是由于操纵子或调节基因突变造成的;即形成的有活性的阻遏蛋白不能与操纵子结合,或不能形成有活性的阻遏蛋白。这类基因中大多数是在生物个体其它组织细胞、甚至在同一物种的细胞中都是持续表达的,是细胞基本的基因表达。这是生物在进化过程中形成的遗传特性。 2)适应性表达(adaptive expression):指环境的变化容易使其表达水平改变的一类基因表达。 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction),这类基因称为可诱导的基因(inducible gene);随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression),这类基因称为可阻遏的基因(repressiblegene)。在原核和单细胞生物中,通过改变基因表达适应环境,对于细胞的生存非常重要。如有充足的葡萄糖,细菌就可利用葡萄糖作能源和碳源,当没有葡萄糖时,细菌就要适应环境中存在的其它糖类(如乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等),开放能利用这些糖的酶类基因,以满足生长的需要。 长期摄取不同的食物,体内合成代谢酶类的情况也会有所不同。 转录水平的调控1、操纵子学说z、y和a是E. coli编码利用乳糖所需酶类的基因,p是转录z、y、a所需要的启动子,调控基因i编码的调控蛋白R可与o结合而阻碍从p开始的转录,o是调节基因表达的操纵基因。乳糖能改变R的结构使其不能与o结合,因而乳糖浓度增高时基因就开放,转录合成所编码的酶类基因,这样E. coli就能适应外界乳糖供应的变化而改变利用乳糖的状况。(乳糖可作为培养大肠杆菌的能源。大肠杆菌能产生一种酶(叫做“半乳糖苷酶”),能够催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,以便作进一步的代谢利用。编码半乳糖苷酶的基因(简称z)是一个结构基因(structural gene)。这个结构基因与操纵基因共同组成操纵子。操纵基因受一种叫作阻遏蛋白的蛋白质的调控。当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时,乳糖会起诱导作用,它与阻遏蛋白结合,使之从操纵基因上脱落下来。这时,操纵基因开启,相邻的结构基因也表现活性,细菌就能分解并利用乳糖了,这样,乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生的诱导物。) 1)操纵子的组成元件:结构基因、启动子、终止子序列等(原核生物的多数基因以操纵子的形式组成基因表达调控的单元,共同开启或关闭,转录出多顺反子(polycistron)的mRNA) ①结构基因群 :一个操纵子中一般含有2个以上的结构基因(structural gene, SG),每个结构基因是一个连续的开放读框(open reading frame),5’-端有翻译起始码,3’-端有翻译终止码。各结构基因头尾衔接、串连排列,组成结构基因群。在第一个结构基因5’侧具有核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS),当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA,就能被核糖体所识别结合、并起始翻译。 ②启动子 :启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵子至少有一个启动子,控制整个结构基因群的转录。启动子一般可分为识别(recognition)、结合(binding)和起始(initiation)三个区段。不同启动子因序列差异而与RNA聚合酶的亲和力不同,启动转录的频率有高有低,即起动基因转录的强弱不同。 ③操纵基因 :操纵基因(operator, O)是一段能被调控蛋白特异性结合的DNA序列,通过与蛋白质的相互作用调控基因表达。操纵基因常与启动子邻近或重叠,当调控蛋白结合在操纵基因上,会影响其下游基因转录的强弱。阻遏蛋白与操纵基因结合,可妨碍RNA聚合酶与启动子的结合及其后基因的转录起始,从而阻遏了这群基因的表达。能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列,不论其对基因转录的作用是减弱、增强、阻止或开放,都称为操纵基因。 乳糖操纵子中的操纵基因(o)序列位于启动子(p)与被调控的基因之间,部分序列与启动子序列重叠。 操纵基因序列具有回文(palindrome)结构。许多操纵子都具有类似的对称性序列,可能与特定蛋白质的结合相关。 ④终止子 :终止子(terminator T)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。操纵子中在构基因群最后一个基因的末端存在一个终止子。 终止子按其作用可分为不依赖ρ因子的强终止子和依赖ρ因子的弱终止子。 强终止子能完全停止转录;弱终止子只是部分终止转录,一部分RNA聚合酶能越过这类终止序列继续沿DNA移动并转录。如果结构基因群中间存在弱终止子,则前后转录产物的量会有所不同,这可作为终止子调节基因表达产物比例的一种方式。有的蛋白因子能减弱或取消终止子的作用,称为抗终止作用(anti termination),这种蛋白因子称为抗终止因子(anti terminator)。 调控基因调控基因(regulatory gene)是编码能与操纵基因结合的调控蛋白的基因。与操纵基因结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白(repressive protein),其介导的调控方式称为负性调控(negative regulation)。与操纵基因结合后能增强或起动调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白(activating protein),所介导的调控方式称为正性调控(positive regulation)。某些特定的物质能与调控蛋白结合,使调控蛋白的空间构像发生变化,从而改变其对基因转录的影响,这些物质称为效应物(effector)。能引起诱导发生的分子称为诱导剂(inducer);能导致阻遏发生的分子称为阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor)。 根据操纵子的作用方式可分为:①调节分解代谢的操纵子,它们都是属于诱导型,并受cAMP-CAP的调节。分解代谢的底物常为小分子诱导物。②调节合成代谢的操纵子,它们都属于阻遏型,不受cAMP-CAP影响。 2、乳糖操纵子(lactose operon) 乳糖操纵子属于可诱导操纵子(inducible operon),在缺乏诱导物时,这类操纵子只有本底水平的表达,约为诱导时表达水平的0.1%左右,lac操纵子的表达水平在诱导和阻遏之间的差别在1000倍。 1)乳糖操纵子的结构 E. coli乳糖操纵子包括:启动子、操纵基因和3个结构基因(Z、Y和A)等 Z编码β-半乳糖苷酶,催化乳糖转变为别乳糖(allolactose),再分解为半乳糖和葡萄糖; Y编码乳糖透过酶,促使环境中的乳糖进入细菌;A编码转乙酰基酶,催化半乳糖乙酰化,可能参与不能分解的β-半乳糖的乙酰化而解毒和排出细胞。 转录过程:转录时RNA pol与启动子结合,通过操纵子,按Z→Y→A方向进行转录。 每转录出一条mRNA上都有Z、Y和A基因。z基因5’侧有SD序列,当Lac operon(乳糖操纵子)开放时,核糖体能结合在mRNA上。同一个核糖体依次翻译基因群所编码的所有蛋白质。 2)阻遏蛋白的负性调控 无乳糖时,Lac操纵子处于阻遏状态。lac i基因在其自身的启动子Pi控制下,低水平、组成性表达产生阻遏蛋白,阻遏蛋白以四聚体形式与操纵基因作用。阻遏蛋白总是与DNA结合在一起,它与操纵基因的结合可加强RNA pol与启动子的结合但不能启动转录。 在诱导物的作用下,阻遏蛋白构象改变而失去与操纵基因(O1)的结合能力。 乳糖操纵子即使在阻遏蛋白的阻遏状态下,也有本底水平的基因表达,由于R与O也偶尔解离,使细胞中有极低水平的β-半乳糖苷酶及透过酶生成。 有乳糖时,乳糖受β-半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖,与R结合使R构象变化,R四聚体解聚而与O解离。 基因转录开放,β-半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。乳糖(别乳糖)作为诱导剂,与R结合起去阻遏作用(derepression),诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放。 3)CRP(细菌中的受体蛋白CRP )的正性调控 大肠杆菌优先利用葡萄糖作为碳源,葡萄糖的存在可防止从培养基中吸收其它碳源。当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时,lac启动子表达受阻,没有β-半乳糖苷酶活性。 CRP上有重要的三个位点参与基因转录激活过程:与RNA pol的 3、色氨酸操纵子(trp operon) 色氨酸操纵子(tryptophane operon)代表了一种衰减调控模式,Trp是构成蛋白质的组分,当有足够的Trp时,操纵子自动关闭。细菌直接利用外界的Trp。 缺乏Trp时,Trp操纵子被打开,5个结构基因表达,产生3个酶催化分支酸合成为Trp。 1)Trp操纵子的结构及负调控 合成Trp所需要酶类的5个基因E、D、C、B、A头尾相接串连排列组成结构基因群;受其上游的启动子P和操纵基因O的调控。 调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群,在其自身的启动子作用下,以组成性方式低水平表达调控蛋白R’。R’并无活性,当提供足够的Trp时,Trp与R’结合使其构象改变而成为活性形式R,R可与O特异性结合,阻遏结构基因的转录,R的阻遏能力仅为lac I产物的1/1000。 这是一种负性调控,即操纵子通常是开放转录的,当有效应物(Trp为阻遏剂)作用时,则阻遏关闭转录。 2)Trp操纵子的衰减调控 当Trp达到一定浓度,但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时,产生Trp合成酶类的量已经明显降低,而且产生的酶量与Trp浓度呈负相关。这种调控现象与Trp操纵子特殊的结构有关。当有一定的Trp存在时,RNA pol会提前终止转录,产生一个140nt的RNA分子,而不转录trp合成的基因。这种先导序列起到随Trp浓度升高降低转录的作用,这段序列就称为衰减子或弱化子(attenuator)。 4、半乳糖操纵子(gal operon) Galactose operon包括3个结构基因(gal E、gal T、gal k)表达产生的异构酶(UDP-galactose-4-epimerase)、半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase)和半乳糖激酶(galactose kinase)参与Gal代谢,形成UDPGal,用于合成细胞壁。 当细胞中缺乏葡萄糖时,这些酶可使Gal转变成G-1-P,供细菌生命活动需要。 1)gal操纵子的结构:gal操纵子属于诱导型操纵子。调节基因galR距离结构基因galE、T、K及操纵区O等很远,而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。Gal是gal操纵子的诱导物。 2)gal操纵子双转录起点的作用 葡萄糖存在时 :若无Gal,Gal R可结合在gal OE和OI上,并相互作用形成环,从P1、P2的转录都被阻遏(?缺gal时,P3的作用可能得到体现)。 当galR仅结合在OE时,P1的转录被阻遏,但P2被激活,P2低水平组成性表达gal操纵子。 当gal存在时,Gal R的阻遏解除,但由于葡萄糖的存在,P1不能启动而只有P2低水平启动转录。 无葡萄糖存在:若存在gal,gal的阻遏解除,依赖于CRP的P1高水平表达产生利用Gal的酶类,以Gal为能源和碳源。gal P2在gal P1的上游(部分重叠),gal P2与CAP位点靠近,在空间位置上CRP的结合抑制了P2的转录。 5、阿拉伯糖操纵子(ara operon) 阿拉伯糖(arabinose)是可作为碳源的五碳糖。 参与阿拉伯糖代谢酶的基因分布于3个操纵子中,但由一个调节基因(araC)的产物调控。 araC基因位于另一个操纵子中,它编码的araC蛋白是这3个操纵子的调控因子。 1) araBAD操纵子的结构 阿拉伯糖操纵子上3个结构基因(araB、araA和araD)编码的3个酶参与阿拉伯糖的降解。 核酮糖激酶(ribulokinase)、L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase)和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(L-ribulose-5phosphate-4-epimerase)。 2)阿拉伯糖操纵子的调控方式 araBAD和araC操纵子中有CRP位点,它们的起始转录需要cAMP-CRP,因此葡萄糖存在时araBAD和araC操纵子均关闭。AraC蛋白的存在抑制araC和araBAD的表达,当无葡萄糖而有Ara存在,Ara可与AraC蛋白结合使araBAD转录。araBAD与一个复合启动子区域和一个调节基因araC相邻。araBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。 araC的自身调节 :当AraC水平较低时,其基因从Pc开始表达。当AraC蛋白浓度高时,由于AraC与AraO1结合,而araO1与AraC基因的启动子重叠,可阻遏araC基因的表达。 翻译水平的调控在原核生物中,mRNA的二级结构和寿命、核糖体蛋白、稀有密码子、营养缺乏的报警物以及反义RNA等都可对翻译水平进行调控 1、稀有密码子对翻译的影响 细胞可通过翻译调控不同蛋白含量的高低。即使对于同一操纵子上不同的基因,其产物在数量上也可大不相同。许多调控蛋白在细胞内含量很低,编码这些蛋白的基因中高频率地使用了很多稀有密码子,稀有密码子对应低丰度的tRNA,因此,翻译速度受tRNA供应的限制,影响了蛋白质合成的总量。 2、重叠核苷酸调控翻译起始 Trp操纵子中的5个基因中E和D分别编码邻氨基苯甲酸合成酶的不同亚基,组成四聚体。E、D产物的量一定要保持一种严格的当量关系,否则造成浪费;同样A和B基因也是分别编码色氨酸合成酶的α亚基和β亚基,产量也要求一致。在E、D两个基因之间存在着翻译偶联效应。trpE的终止密码子和trpD的起始密码子重叠。当trpE翻译终止时,核糖体并不解离而偶联翻译trpD。trpB和trpA也有同样的关系。 3、核糖体蛋白翻译水平的调控 大肠杆菌的核糖体中含有50多种蛋白,各种核糖体蛋白在体内的量是平衡的,它们与rRNA组装成核糖体。 在核糖体组装时,与rRNA结合的蛋白为关键蛋白,它对核糖体蛋白的合成起调控作用,每一个操纵子编码自己的关键蛋白,它抑制整个操纵子的表达。 某种r蛋白合成过快时,关键蛋白可与其模板mRNA上的SD序列结合而使其不能与核糖体结合,导致mRNA的降解而使这种r蛋白合成速度降低。与关键蛋白结合的rRNA和r蛋白的mRNA有同源性。当核糖体蛋白的mRNA表达过量时,关键蛋白较多地与核糖体蛋白的mRNA结合,导致其不能与rRNA结合形成核糖体。这样就可调控核糖体蛋白的合成。 4、细菌营养缺乏调控 细菌在葡萄糖缺乏时可产生报警物质cAMP。可保证其利用其它糖类,如lac操纵子、gal操纵子和ara操纵子等。 培养基中营养缺乏,蛋白质合成停止,RNA合成也趋于停止,这种现象称为严紧控制。 细菌缺乏氨基酸时会产生鸟苷四磷酸(ppGpp,魔斑)和鸟苷五磷酸(pppGpp)作为报警物质。 细菌缺乏任何一种氨基酸时,无负载的tRNA与核糖体A位点结合,这可能导致与核糖体结合的应急因子Rel A被激活,一个空载的tRNA进入A位会生成报警物质。 5、反义RNA 反义RNA(anti sense RNA)是与mRNA互补的RNA分子 1)反义RNA的作用 反义RNA能与mRNA分子特异性地互补结合,从而抑制该mRNA的加工与翻译。可调控原核细胞中基因表达、控制噬菌体溶菌-溶源状态以及抑制转座子的转位作用等。 通过人工合成反义RNA的基因,并将其导入细胞内转录出反义RNA,即能抑制特定基因的表达,阻断该基因的功能,有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。同时也有对肿瘤实施基因治疗的可能性。 2)反义RNA的作用机制 ①反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和(或)编码区,引起翻译的直接抑制或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶Ⅲ的敏感性增加,使其降解。 ②反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合,从而抑制靶mRNA的翻译功能。其作用机制可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后阻止了核糖体的结合。 ③反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。 3)人工合成构建反义RNA 通过人工设计在天然状态下不存在的反义RNA可调节靶基因的表达。 在原核生物中针对SD序列及其附近区域的反义RNA的作用可能更有效。 在真核生物中,对应于5'端非编码区的反义RNA比针对编码区的反义RNA更有效。也有实验表明针对第一内含子的反义RNA也同样有效。 1、
1)溶源途径 : 2)溶菌途径 :噬菌体感染宿主后也可以利用细菌细胞内的养料进行繁殖,最终使宿主裂解而死亡,这一过程称为溶菌途径。溶源化的细菌受某些外界物理或化学因素(如紫外线、丝裂霉素C等)的作用原噬茵体便脱离细菌染色体而进行自主复制,于是细菌裂解,游离出大量的噬菌体,这一过程称为诱导。 2、
1)与调节控制有关的调节区(regulation) :N编码的N蛋白抗终止子tL1、tR1和tR2;Q编码的Q蛋白抗终止子tR4。cⅠ、cⅡ和cⅢ基因编码的CⅢ蛋白使CⅡ蛋白稳定,CⅡ和CⅢ蛋白能使cⅠ基因启始转录,CⅠ蛋白是 2)与重组有关的区域(recombination):重组区基因主管 3)与复制有关的复制区(replication):O、P基因 4)结构基因区:包括头、尾、装配和裂解有关的基因
1) 总控制操纵子:CⅠ 蛋白操纵子(左向) 2) 左向早期操纵子:PL1 可转录出L1 和L2 的mRNA 3)右向早期操纵子:PR1 可转录 出R1 、R2 、R3 的mRNA 。 4)右向晚期操纵子:PR’可转录出R4和R5的mRNA。 3、
1) ①λphage 进入细菌后成环状 ②CⅡ、CⅢ、O、P蛋白的合成 ③在CⅡ、CⅢ蛋白作用下,PRE(PRE主管建立溶源,repressor for establishment of lysogeny,位于cro和cⅡ之间)的操纵子向左转录了包括cⅠ的基因。 ④CⅠ和Cro是调节蛋白(Cro由PR编码) ,CⅠ和Cro都可结合于左右2个操纵子上,但与每个操纵子中的不同位点的亲和力不同。 ⑤是否进入溶菌途径在于CⅠ和Cro与各个操纵基因的结合(Cro是进入溶菌途径的关键蛋白)。 2)溶源途径的建立 ①λphage DNA进入细菌首先表达N和Cro,此后左向的PN转录继续延伸使CⅢ表达,同时右向的转录使CⅡ表达。 ②CⅠ是进入溶源途径的关键蛋白。CⅠ表达(PRM、PRE)需CⅡ和CⅢ的帮助。寄主hfl产物可水解CⅡ。因此,hfl产物对CⅠ是负效应。 ③hfl表达受cAMP负调控,寄主细胞碳源和能源缺乏时,cAMP增高。使hfl产物活性降低,同时,CⅢ抑制hfl产物活性。因此,CⅡ增加。 ④寄主himA受cAMP-CAP正调控,himA参与λ 与寄主染色体整合(寄主整合酶在碳源馈乏时活性也增高)。 ⑤phage感染复数(multiplicity of infection,MoI)高时,CⅡ由单体转变为有活性的寡聚体,与CⅢ一起帮助PRE转录出CⅠ,CⅠ可抑制cro的表达,进入溶源途径。因此,营养耗竭、噬菌体感染复数高时进入溶源途径。 |
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