新型双压线性离子阱质谱仪给蛋白质组学带来革命性变化

Tonya Pekar Second, Justin Blethrow, Jae C. Schwartz, Vlad Zabrouskov, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA

关键词：

LTQ Velos  线性离子阱，蛋白质学，蛋白鉴定，肽测序、灵敏度、蛋白质组发现者

引言：

对于一个蛋白质组全面的了解是研究动态蛋白质组的基础。蛋白质的鉴定是需要有效、稳定可靠的方法。串联质谱尤其是线性离子阱和基于阱的杂交质谱仪日益成为肽段和蛋白质鉴定的首选。选择此类仪器的主要原因在于该类仪器具有良好的稳定性、重现性、易用性以及良好的一级和二级谱图质量。

在一个蛋白质组体系里，经常会存在一些低丰度不易被质谱仪鉴定到的蛋白，其中某些蛋白还会存在一些动态修饰，就更难被仪器检测到。因此，需要发展更先进灵敏度更高的一切来应对复杂蛋白质组蛋白鉴定的需求。

本篇应用论文主要介绍了用新型双压线性离子阱质谱仪分析复杂、Caenorbabditis elgans(C.elegans)的肽段混合物。比较了新型双压线性离子阱质谱仪与线性离子阱和广泛应用的四级杆-飞行时间质谱仪的性能。

仪器创新

在本篇文章主要测试Thermo Scientific 的LTQ Velos离子阱质谱仪。它包括了一个新型双压线性离子阱和高压环形离子导入装置（S-Lens），如图1所示。

S-lens的射频显著提高了离子注入到质谱仪中，这降低了在线性离子阱中离子累积所需要的时间。

双压阱的第一个池的压力比以前线性离子阱的压力要高，大约在5×10-3Torr，这能够显著提高目标离子的捕获效率、分离效率和碎裂效率。提高的分离效率显著降低了前体离子所需要的时间，所需时间是从前的四分之一。LTQ Velos离子阱对于在有高丰度干扰离子背景下低丰度前体离子具有较好的选择性，提高了二级质谱分析的动态范围。高压也缩短了碰撞诱导解离所需的时间的67%，同时保持了同样的碎裂效率。第二个池保持较低的压力，大约在4×10-4Torr，可以以较高的分辨率进行快速质量分析。

高捕获效率

高裂解效率

高分离效率

5×10-3  氦气

高分辨率、扫描速度

3.5×10-4  氦气

图一 LTQ Velos 质谱仪，高压环形离子导入装置（S-Lens）和新型双压线性离子阱（不同压力控制）

与新型双压线性离子阱协力合作，在典型的数据依赖模式的串联质谱实验中，在阱里一种新型控制离子累积的方法能显著提高实际的扫描速率。这个功能叫做“预测AGC”，去除了每一次串联质谱扫描所做的预扫，基于离子流出和前一次一级质谱全扫描的母离子的相对强度，预测了离子累积所需要的时间。

实验

样品制备

C.elgans匀浆液的可溶性部分用pH7.8的碳酸氢铵稀释，加入0.1%的RapiGest表面活性剂，解释用二硫苏糖醇在100℃还原二硫键，并用碘乙酰胺对半胱氨酸烷基化。样品解释用对K/R特异性酶酶切4个小时。酶解物质酸化后存放至-80℃。在进入反相高效液相色谱-串联质谱前用0.1%的甲酸稀释。

液相色谱-串联质谱分析

为了比较和评估性能，在Thermo Scientific的LTQ XL线性离子阱质谱仪和安捷伦6520四级杆-飞行时间质谱仪一级LTQ Velos双压线性离子阱质谱仪对C.elegans的蛋白酶解物进行了分析，肽段混合物是在反相色谱进行分离的。详细的色谱条件请参照表1。同时对减少进样量进行了考察。

在所有实验中，均采用数据依赖的串联质谱采集方法。在每一台仪器上至少运行3次样品。

对于线性离子阱的数据依赖模式检测方法，该方法主要分析十个最强的离子，根据色谱峰的峰宽，优化排除条件，色谱峰的峰宽主要是根据反相梯度长度变化。由于在LTQ Velos质谱仪离子源有较好的离子传输，因此一级质谱全扫描需要较低的最大注射时间。在进行二级质谱扫描的时候，可用同样的最大注射时间，这样可以捕获更多的例子，进而鉴定得到低丰度的肽段（前体离子丰度较低，AGC的注射时间达到最大）。在LTQ Velos前体离子的选择上采用数据依赖的模式，对一级质谱信号设置更高的阈值。离子转移管的温度为250℃，比LTQ XL更高，目的是补偿短的毛细管长度。碰撞诱导解离的时间从30ms降至10ms，充分利用更高的压力池，提高碎裂效率。LTQ Velos双压离子阱对于正常扫描模式同时提供了碎裂效率和扫描速率，而且阻止了单电荷的前体离子的传输。在数据采集模式充分利用了这个特点，详细的采集参数如表2所示。

6520四级杆飞行时间质谱仪（Q-TOF）的采集参数如表3所示。采用了3Hz和6Hz的扫描速率，以最大化实现对肽段进行鉴定，实际有效的扫描速率为2.5Hz或5.1Hz。参数设置参考了安捷伦的技术支持，同时也与推荐文献报道相类似。

数据库搜索

通过用Thermo Scientific蛋白质组学发现1.0（Proteome Discovery)软件和英国伦敦Matrix Sciences公司的Mascot2.1搜索引擎对数据进行检索，比较离子阱和四级杆-飞行时间质谱仪所采集的数据。用于数据库搜索的条件如表4所示。在Mascot中选中反相库检索选项，对所有的数据进行过滤，保证1%或更低的的假阳性率。用安捷伦的软件Masshunter将6520的四级杆-飞行时间质谱仪所采集的数据转换为mzdata格式，然后提交到蛋白质组学发现（Proteome Discovery)软件。Proteome Discovery软件会自动计算期望得分（或肽得分，如果选中的话）来过滤数据，达到满足特定的假阳性率，然后将该过滤方法应用到数据集中。

因此，选择高置信度的肽段过滤条件来使最终检测到的蛋白满足1%或更低的的假阳性率。将数据库检索得到的特异性肽段的数量和蛋白数进行比较。

仪器

Thermo Scientific 离子阱

Q-TOF（四级杆-飞行时间质谱）

HPLC（高压液相色谱）

Thermo Scientific Surveyor MS Pump

Agilent 1200 Series HPLC

离子源

Nanospray I

Agilent HPLC-Chip/MS System

分析柱

Michrom Magic C18AQ packed tip

150 mm x 75 μm I.D. x 15 μm tip

5 μm particle, 250 Åpore size

Agilent Protein ID Chip #3 (up to 4 μg capacity)

SB-ZORBAX C18

150 mm x 75 μm I.D.

5 μm particle, 300 Åpore size

流速

~ 300 nL/min at 50% organic

300 nL/min

梯度

2-25% acetonitrile in 0.1% formic acid(either 60 minutes or 180 minutes)

5-30% acetonitrile in 0.1% formic acid(either 60 minutes or 180 minutes)

表1 肽段一维反相色谱分离条件

质谱仪

LTQ Velos

(LTQ XL)

毛细管温度

250 °C

(200 °C)

离子源参数

S-Lens 40%

(Tube Lens 100 V)

AGC Targets Full

MS: 3e4

MSn: 1e4

最大注射时间

一级质谱: 10 msec (Full MS: 50 msec)

多级质谱: 100 msec

一级质谱扫描范围

400-1200 m/z

隔离宽度

2 m/z

碰撞类型

CID 碰撞诱导解离

归一化能力

30%

碰撞时间

10 msec

(30 msec)

缺省带电量

3

DDA选择阈值

1000

(10,000)

方法

Top 10 most intense DDA

Number of Microscans

1

扫描速率

正常

排除单电荷

是

否

动态排除功能

Exclusion duration:

排除周期15 sec (60 min), 30 sec (180 min) List size: 500

Repeat count: 1 Mass width: low-1.0, high 1.5

表2： LTQ Velos and LTQ XL 质谱仪采集参数

质谱仪

Agilent 6520 Q-TOF

ESI 条件

HPLC-Chip NSI Interface

芯片气体温度

300 °C

干燥器温度

4 L/min

一级质谱采集频率

3, 6, or 8 Hz

二级质谱采集频率

3 or 6 Hz

一级质谱扫描范围

200-2000 m/z

碰撞能力

Slope: 3 V

Offset: 2 V

方法

Top 6 DDA

Precursors sorted by abundance 按照丰度排序前体离子

带电量选择

拒绝单电荷

动态排除

Duration: 30秒 (60 min),

60秒 (180 min)

Repeat count: 1

表3 四级杆-飞行时间质谱仪采集参数

软件平台

Proteome Discoverer

搜索引擎

MASCOT v 2.1

数据库

NCBI, April 2008

最大漏切数目

1

前体离子容忍度

离子阱数据: 1.4 Da

四级杆飞行时间质谱数据: 40 ppm

碎片容忍度

离子阱数据

四级杆飞行时间质谱数据: 100 mmu

蛋白质量

不限制

反库搜索

使用

仪器类型

离子阱数据: ESI-TRAP

四级杆飞行时间质谱数据: ESI-Q-TOF

修饰

固定修饰: 半胱氨酸烷基化

得分

MUDPIT scoring

蛋白 cut-off: 20

肽 cut-off: 10

DTA 产生条件

总离子强度阈值: 100

最小离子数: 10

信噪比阈值：2 前体离子范围 700-5000 m/z (离子阱), 700-7000 m/z (四级杆-飞行时间质谱)

Table 4: 数据分析数据库搜索条件

结果与讨论

LTQ Velos比LTQ XL和Q-TOF鉴定到了更多的特异性肽段

图2：1ug C.elegans酶解样品在60分钟内运行色基峰色谱图比较（上图为LTQ Velos双压离子阱质谱仪，下图为四级杆飞行时间质谱仪）

与线性离子阱LTQ XL和四级杆-飞行时间质谱仪Q-TOF相比，LTQ Velos双压离子阱质谱仪从C.elegans的胰酶酶解物中鉴定得到了更多的特异性肽段。有更多的蛋白被鉴定到。图2显示的是在60分钟的梯度内用反相色谱-LTQ Velos质谱仪得到的基峰色谱图，以及用1200高效液相色谱-芯片分离-四级杆飞行时间质谱一得到基峰质谱图。在60分钟的分离过程，LTQ Velos质谱仪比LTQ XL质谱仪多鉴定了67%的特异性肽段，比Q-TOF多鉴定了165.7%的特异性肽段，上述结果都是在3Hz情况下得到的。在相同的实验过程中，LTQ Velos离子阱鉴定到蛋白的数目比四级杆-飞行时间质谱仪Q-TOF多了240%。在实验中，鉴定到的蛋白和特异性肽段的数目都是三次重复实验取的平均值，而且相对标准偏差小于10%。每一次运行样品，平均百分比都增加了，但并不是所有重复数据都增加了。

图3 样品：1ug C.elegans蛋白胰酶酶解物在反相色谱分离。LTQ Velos双压离子阱比LTQ XL离子阱和四级杆-飞行时间质谱仪能鉴定到更多的特异性肽段和蛋白。图中所示为两个梯度的结果，也标出了每一个仪器的实际采样速率。

如图4所示，在不同仪器之间，有很多蛋白会重复出现，即被不同仪器同时鉴定到。在60分钟的分离过程中， LTQ Velos双压离子阱鉴定到了LTQ XL得到到蛋白数目的88%，LTQ Velos双压离子阱鉴定到了Q-TOF得到蛋白数目的90%，此外，还有570个蛋白没有被其他仪器鉴定到，大约占53%。因此，LTQ XL和Q-TOF鉴定到的蛋白大部分都被LTQ Velos鉴定到，而且还有许多上述两仪器没有鉴定到的。在LTQ Velos反复对同一样品进行分析的时候，能重复鉴定到的蛋白超过70%，而且有85%的蛋白能过被鉴定到两次或三次，说明LTQ Velos的重现性较好.

图4  1ug C.elegans蛋白胰酶酶解物在60分钟内用反相色谱分离，不同仪器鉴定到的蛋白。（1%假阳性率）

LTQ XL

LTQ Velos

增加百分比

信号转导蛋白

21

49

133%

激酶

11

24

118%

磷酸酶

15

31

107%

表5 用LTQ Velos离子阱比LTQ XL离子阱能鉴定得到更多的信号转导蛋白

LTQ Velos有更好的灵敏度

在复杂混合物中，由于低丰度的前体离子存在于宽动态范围的背景基质中，需要很好的灵敏度（很强的信号），而且需要好的选择性，目标离子的选择效率以及能应对复杂体系的采集速度。LTQ Velos质谱仪对于在高度复杂背景下关键低丰度蛋白的检测有更好的灵敏度。用Proteome Discovery软件对检索得到的蛋白结果进行注释，如功能，亚细胞位置等。这些信息来源于公共的蛋白数据库（如Swissprot 和NCBI）,在180分钟的梯度运行一次目标样品，将检索到的蛋白进行分类，LTQ Velos双压离子阱比LTQXL多检出了133%的信号转导蛋白，而且多检测了两倍数目的激酶和磷酸酶。

此外，只有LTQ Velos双压离子阱鉴定到了低丰度的的转录因子ntl-3，它主要参与生长调控，还鉴定到了F4369主要参与细胞定位。

为了进一步证明LTQ Velos双压离子阱对于分析低丰度化合物的能力，比如在组织或细胞里天然丰度较低的蛋白或肽段，样品被稀释了50倍，在两台线性离子阱上进行分析，由LTQ Velos双压离子阱鉴定得到的特异性肽段比LTQ XL多152%，主要是由于LTQ Velos双压离子阱有高灵敏的二级质谱鉴定能力，有更好的离子传输效率，对于弱的前体离子信号，LTQ Velos双压离子阱能在有限的最大注射时间内传输更多的离子到阱内，因此提高了二级质谱的灵敏度，LTQ Velos双压离子阱由较快的扫描速率，也增加了低丰度的前体离子被鉴定到的几率。

图5  20ng进样量 60分钟的色谱梯度 LTQ Velos双压离子阱比LTQ XL离子阱能增加对低丰度蛋白鉴定的量。

LTQ Velos双压离子阱提高实验通量

快速的扫描速率，不但提高了仪器工作循环的次数，同时也缩短了色谱分离时间，提高了实验的通量，对于同一个复杂混合物，LTQ Velos双压离子阱在60分钟内鉴定到的特异性肽段比LTQ XL离子阱在180分钟内鉴定到的还要多，因此，对于简单而又有宽动态范围（如胶条带）的混合物分析，可以显著提高其通量。对于某些需要多次重复的实验，如方法开发，或涉及生物样品重复的实验，用此仪器就非常方便快捷。同样对于定量试验，用LTQ Velos双压离子阱也具有很大的优势，因此它有较快的扫描速度，更多的扫描次数，可以对较窄的色谱峰进行多个数据点的采集，因此适用于超高压液相色谱分离和短运行时间的分析实验。

为什么四级杆飞行时间质谱仪（Q-TOF）仪器鉴定的蛋白较少

对来源于Q-TOF仪器的数据进行详细分析，一级质谱全扫描的谱图质量与LTQ Velos几乎相当，而且信噪比和谱图特征也很类似，而且Q-TOF有更好的质量准确度（在1%假阳性率鉴定到的肽的RMS有9PPM），结果显示，在一定的分析时间内如60分钟，对于肽段鉴定的实验来说，全扫描的灵敏度、动态范围、或质量准确度不是决定因素，扫描速率可能是一个决定性因素，随着分离时间延长，扫描速率影响不是特别大，但肽和蛋白鉴定数目也提高了，如图3所示。对于扫描速率的详细讨论，请参考下面的Q-TOF扫描速度对灵敏度的影响。

由LTQ Velos双压离子阱鉴定到的前20个蛋白的Mascot平均得分为1113.4，在3Hz扫描速度工作下的Q-TOF前20个蛋白平均得分为506.7，前者是后者的一倍还多。Q-TOF的二级质谱图质量较差，导致了较少的肽段被鉴定到。Q-TOF一级质谱和二级质谱的高质量准确度并没有弥补低质量的二级质谱谱图。如，与线性离子阱获得的质谱图相比，有较少的序列离子，当检索参数设置为MS1.4Da MS/MS 0.8，离子阱的二级质谱扫描谱图质量已经够高，结果显示，线性离子阱（LTQ）系统比四级杆-飞行时间（Q-TOF）在蛋白鉴定更具优势。

图6  1ug C.elegans蛋白胰酶酶解物在反相色谱分离的基峰图，四级杆飞行时间质谱和LTQ Velos线性离子阱全扫描动态范围的比较

Q-TOF扫描速率对灵敏度的影响

如图7所示，将Q-TOF扫描速率从3Hz升至6Hz，导致鉴定到肽段数目减少，这主要是因为随着Q-TOF质谱仪的扫描速率提高，一级质谱图特别是二级质谱图质量下降。增加的扫描速度减少了离子的传输时间，由于较少的离子被检测到和平均化，因此降低了谱图的信噪比。如图8所示，将Q-TOF扫描速率从3Hz升至8Hz，损失了66%的Q-TOF信号，在二级质谱图可检测到的特征离子数目减少了。

增加的MS/MS采集的扫描速率，降低了二级质谱图的质量和信噪比，而且Mascot鉴定到的肽段的得分也受影响，如图9所示，二级质谱图扫描几乎来源于色谱峰的顶点。在高质量Q-TOF3Hz谱图下，Mascot得分为49分，而且LTQ Velos双压离子阱对于同一样品，进样量只有Q-TOF80%的时候，Mascot的得分为103分，前者比后者低了53%，当Q-TOF在6Hz运行时，对于1μg的样品在180分钟的运行时间内，鉴定到的肽段数目下降了40%，这就是为什么尽管仪器的扫描速率可以达到10Hz，在做肽段鉴定实验过程中，厂家不建议其采样速率超过3Hz的原因。

拥有专利技术的pAGC，在阱内可实现离子累积，LTQ Velos双压离子阱不管前体离子的峰强度，对于二级质谱的离子数目进行优化，结果显示，在180分钟的梯度内，在实际扫描速率为6.3Hz运行下的LTQ Velos双压离子阱比6Hz运行下的四级杆飞行时间质谱（Q-TOF）多检测到了282%个特异性肽段。

图7  1ug C.elegans蛋白胰酶酶解物在180分钟内用四级杆-飞行时间质谱仪（3Hz和6Hz）和LTQVelos线性离子阱鉴定到特异性肽段数目的比较

图8 在Q-TOF仪器上比较不同质谱扫描速率下信号的强度

图9  四级杆-飞行时间质谱在两个不同二级质谱扫描速率下，对同一个二价前体离子     LVGDLDDAQVDVER二级质谱图的比较。而LTQ Velos离子阱对同一前体离子检测只用了80%的样品量

结论：在一个复杂的蛋白质组样品中，高灵敏的检测和鉴定化合物对于了解和认知动态蛋白质学具有极其重要的意义。随着技术的革新，LTQ Velos双压线性离子阱质谱仪的出现，，大幅度提高了肽段和蛋白鉴定的个数，与当前主流的技术相比，LTQ Velos双压线性离子阱质谱仪由于其超高的采集速度和高的灵敏度，增加了低丰度的前体离子的鉴定数目。

l   在一个复杂混合样品中，LTQ Velos 离子阱比四级杆-飞行时间质谱能多鉴定240%个蛋白质和130%个特异性肽段，而且，通过四级杆-飞行时间质谱鉴定到的蛋白，有90%以上都能在LTQ Velos看到。

l   LTQ Velos双压线性离子阱对于低含量的物质有较高的灵敏度。上样量在20ng的时候，与LTQ XL离子阱相比，LTQ Velos双压线性离子阱对于特异性肽段的鉴定增加了150%。

l   随着鉴定蛋白数目的增多，LTQ Velos双压线性离子阱给出了更多的低丰度的蛋白，在这里面，对与信号转导蛋白的量提高了133%。

l   LTQ Velos双压线性离子阱提高了实验的通量，对于复杂样品的分离，比LTQ XL离子阱在三分之一的分离时间里，鉴定了更多的蛋白和肽段。

l   相比四级杆-飞行时间质谱仪，在线性离子阱中能得到更高质量的二级质谱图，这样在Mascot检索中能得到更高的分数。通过四级杆-飞行时间质谱仪得到高质量准确度的图对于肽段的鉴定是有益的但还不够。

l   提高四级杆-飞行时间质谱仪的扫描速度会降低一级质谱和二级质谱图的信号和谱图质量，同时导致减少鉴定到肽段的数目。

参考文献

1.   Horn, D.M., Miller, C.A., Miller, B.D. The Effect of MS/MS Fragment  Mass Accuracy on Peptide Identification in Shotgun Proteomics. Application Note 5989-7820 EN. www.agilent/chem/proteomics

感谢

感谢华盛顿大学基因科学系Gennifer Merrihew提供C.elegans样品。

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