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作者：

吴铭

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摘要：

胶原蛋白是广泛分布于动物结缔组织中,对维护细胞,组织,器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用.胶原蛋白肽是胶原蛋白在一定得外部条件下发生水解后得到的产物.胶原蛋白肽和胶原蛋白二者之间没有严格的区分,只是肽链长短的区别,过去都叫做胶原蛋白.胶原蛋白和胶原蛋白肽都能参与细胞的分化和增殖,能使骨,腱和皮肤具有机械强度;由于其富含很多亲水性基团所以还具有很好的保湿性,同时由于胶原蛋白肽具有良好的生物相溶性,是其再美容,创伤,矫形,烧伤,组织修复等很多医药卫生领域用途非常广泛.目前胶原蛋白的生产主要是用酸,碱水解法从动物结缔组织中提取,提取过程中或多或少都会丧失生物活性,应用于人体时会产生异体或者异种的排异反应,且存在着极大的病毒隐患.随着分子生物学的快速发展,诸多学者为了能充分利用胶原蛋白的优良性能,同时避免动物来源的病毒高风险,开始利用基因工程技术,选用各种宿主细胞生产重组人胶原蛋白.但是由于胶原蛋白的结构,组成,功能及分布上的特点,使得在原核生物细胞中对其进行表达变得十分困难,特别是要表达出完整的具有功能性的胶原蛋白根本就不可能.因此,国外虽然早就在真核系统中表达出多种胶原蛋白,但很少有在原核表达系统中对胶原蛋白或其片段进行表达的报道.但是原核表达体系与其他表达体系相比,大肠杆菌E. coil作为真核基因的表达宿主具有很多优点,例如遗传背景清楚,技术操作简便,培养条件简单,大规模发酵成本低,繁殖快及生长周期短等,因此本研究选用大肠杆菌表达体系,利用基因工程法生产胶原蛋白肽. 对地球表面生物而言,受紫外线辐射影响的主要是中波紫外线和长波紫外线.中波紫外线主要与灼伤和皮肤癌有关,长波紫外线与皮肤光老化密切相关.国外喜欢日光浴使皮扶黝黑,皮肤癌的发病率较高,因而对中波紫外线的研究较多;但是到达地面的紫外线中主要是长波紫外线(占95%),而中波紫外线占极少部分.并且长波紫外线的穿透力远远大于中波紫外线,长波紫外线不仅容易穿透到人体皮肤基底层引发表皮基底细胞的损伤,并可深达真皮层,损伤成纤维细胞,引起细胞因子分泌及基因表达的改变,导致过多基质降解,造成了在光老化过程中结缔组织的损伤.我国人群皮肽类型大多属于Ⅳ型,易晒黑,不易晒伤,皮肤癌的发病率极低,具有现实意义的是重点防治长波紫外线而不是中波紫外线.目前国内外对长波紫外线研究相对较少,所以本实验选用长波紫外线(UVA)做为辐射源的研究对象. 目的:通过基因工程技术在大肠杆菌中高效表达六型胶原蛋白肽(CW-CP6)及重组蛋白,经过纯化获得具有生物活性的重组蛋白,并且对重组蛋白的生物活性进行初步验证,以期广泛应用于科研及临床研究. 方法:在不改变氨基酸序列的前提下,我们用本实验室已经利用RT-PCR技术获得的含有目的基因质粒为模版获得目的基因,然后重组入pET-32a表达载体并转化至大畅杆菌中经过PCR和双酶切鉴定后,将阳性转化子转化入E. coll BL21,E. coll BL21 (DE3), E. coli BL21 (DE3) plysS, Rosetta (DE3)中,随机筛选阳性转化子进行lPTG诱导表达,然后选择表达量高的宿主菌的转化子送测序鉴定.将测序正确而且表达量相对最高的重组转化子命名为pET32a-CW-CP6,将筛选出来的高效表达的菌株做为工程菌进行后期研究.随后对工程菌的发酵条件进行优化探讨,以获得适合该菌株生长与生产目的蛋白的最适条件.工程菌经IPTG诱导表达目的蛋白后,利用亲和层析纯化目的蛋白. 本研究从皮肤细胞光防护的角度,探讨重组蛋白对UVA照射致人成纤维细胞和角质形成细胞损伤的保护和修复作用.实验中我们以体外培养人胚皮肤成纤维细胞和人永生化角质形成细胞株为研究对象,同时以接近到达地球表面太阳光UVA(5J/cm2)为照射源,并采用纯化的目的蛋白进行干预,利用MTT法测定细胞增殖活性,Annexin V/PI流式细胞分析法和Tunel法检测重组蛋白对UVA造成的细胞凋亡作用. 结果:成功的构建并筛选出达量相对最高的重组转化子命名为pET32a-CW-CP6,筛选出高效表达重组蛋白的工程菌株.表达的重组蛋白的分子量约为46KDa,实验表明重组蛋白大部分以可溶形式存在于大肠杆菌中,经Ni-NTA柱亲和纯化后,Western blotting分析证实,纯化后产物是成熟的胶原蛋白肽.经HPLC分析,蛋白纯度可达90%以上.重组蛋白的最佳表达条件为最佳培养条件:LB液体培养基,接种量为5%,培养值OD值为0.6-0.7时添加终浓度为0.5mmol/L ITPG,诱导表达5h,表达的重组蛋白含量最高.通过两组细胞的体外实验得出,两种细胞UVA照射组的OD值明显低于对照组(P0.01或P0.05),差异具有统计学意义,说明UVA照射成纤维细胞和HaCaT细胞后,细胞的增殖受到抑制;UVA+重组蛋白组的OD值均高于UVA辐射组(P0.01或P0.05),差异具有统计学意义,提示重组蛋白对UVA导致的两种细胞增殖损伤具有保护和修复作用.本研究还用Annexin V/PI流式细胞分析法和Tunel法检测重组蛋白对UVA造成的细胞凋亡作用,结果都显示,各组终浓度的CW-CP6作用于UVA辐射的人成纤维细胞和角质形成细胞,无论是细胞的早期凋亡率还是总凋亡率均较正常对照组显著升高.而我们所研究的CW-CP6具体抗体外线作用机制还有待进一步研究.本研究为CW-CP6的基础研究和临床应用及药物的开发利用提供了理论和实验依据,同时也进一步为辐射损伤的防护提供了重要的实验依据.

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关键词：

长波紫外线 胶原蛋白肽 大肠杆菌 HSF HaCaT

被引量：

8

年份：

2011