使用说明： 1. DNA转染： a. 细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿可参考六孔板)：在转染前一天(18-24小时)按照每孔约20-70万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到六孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约70-80%。 b. 在进行下述转染步骤前，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清和抗生素的完全培养液)。对于Lipo8000™转染试剂，抗生素的存在不会影响转染效率，也不会在细胞转染后导致细胞毒性。 c. 参考下表，取一个洁净无菌离心管，对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，加入125μl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM® Medium，加入2.5μg质粒DNA，并用枪轻轻吹打混匀；再加入4μl Lipo8000™转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。配制完成后，室温存放6小时内稳定。

注1：对于六孔板中一个孔的细胞，Lipo8000™转染试剂的用量可以在2-6μl范围内进行适当调节，DNA用量建议固定在2.5μg，但也可以在1-4μg的范围内进行适当调节。通常质粒用量(μg)和Lipo8000™(μl)的用量比例为1:1.6或1:2.5比较常用，如有必要可以在1:0.5-1:5的范围内优化转染效果，上表推荐的比例为1:1.6，此时Lipo8000™的用量相对较少，既经济又高效。最佳的转染条件，因不同的细胞类型和培养条件而有所不同，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。 注2：质粒的浓度宜控制在0.5-5μg/μl范围内。 注3：对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况，可以把每个孔所需的Lipo8000™转染试剂和DNA按照相应倍数加大用量，然后一起混合在同一个离心管内，后续混匀后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。 注4：对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。 d. 无论贴壁细胞还是悬浮细胞，按照六孔板每孔125μl Lipo8000™转染试剂-DNA混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。 e. 继续培养约24-48小时后，即可用适当方式检测转染效果，例如荧光检测、Western Blot、ELISA、报告基因等，或加入适当的筛选药物如G418等进行稳定细胞株的筛选。 2. siRNA转染： a. 细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿可参考六孔板)：在转染前一天(18-24小时)按照每孔约20-70万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到六孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约70-80%。 b. 在进行下述转染步骤前，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清和抗生素的完全培养液)。对于Lipo8000™转染试剂，抗生素的存在不会影响转染效率，也不会在细胞转染后导致细胞毒性。 c. 参考下表，取一个洁净无菌离心管，对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，加入125μl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM® Medium，加入100pmol siRNA，并用枪轻轻吹打混匀；再加入4μl Lipo8000™转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。配制完成后，室温存放6小时内稳定。

注1：对于六孔板中一个孔的细胞，Lipo8000™转染试剂的用量可以在2-6μl范围内进行适当调节，siRNA用量可以在50-250pmol的范围内进行适当调节。通常siRNA用量(pmol)和Lipo8000™(μl)的用量比例为25:1，如有必要可以在10:1-40:1的范围内优化转染效果，上表推荐的比例为25:1，此时Lipo8000™的用量相对较少，既经济又高效。最佳的转染条件，因不同的细胞类型和培养条件而有所不同，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。 注2：siRNA的推荐浓度为20μM，常用的浓度范围为10-50μM。 注3：对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的Lipo8000™转染试剂和siRNA按照相应倍数加大用量，然后一起混合在同一个离心管内，后续混匀后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。 注4：对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。 d. 无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，按照六孔板每孔125μl Lipo8000™转染试剂-siRNA混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。 e. 继续培养约2天左右后，即可用适当方式检测siRNA对于靶基因的下调效果，例如qPCR、Western、ELISA、报告基因等。对于有些半衰期比较长的目的基因需要在转染siRNA或miRNA后3-5天，才能检测到RNA或蛋白水平的显著下降。 常见问题： 1. 转染效率低： a. 优化质粒与Lipo8000™转染试剂比例，对于难转染的细胞，可适当增加Lipo8000™转染试剂的用量。 b. 应使用高纯度、无菌、无污染物的质粒进行转染，DNA纯度方面A260/A280比值要接近1.8，通常宜控制在1.8-1.9范围内，偏低则有可能有蛋白污染，偏高则有可能有RNA污染。可以使用碧云天生产的质粒大量抽提试剂盒(D0026)进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。 c. 贴壁细胞转染时状态良好，细胞密度达70-80%时才可进行转染，过稀或过密都可能影响转染效率，不同细胞的最佳转染密度需要自行摸索。悬浮细胞宜在对数生长期进行转染。 d. 需使用无抗生素和无血清培养液配制Lipo8000™转染试剂和质粒或siRNA等的混合物。 e. 转染后培养时间不足，而被误以为转染效率偏低。不同细胞转染后至显著表达所需要培养的时间通常为24-48小时。 f. 检查细胞是否有支原体感染，支原体感染会影响细胞增殖，并很可能影响转染效率。 g. 使用传代次数相对较少的细胞，细胞传代次数太多，对转染效率会有一定的影响。 h. 如果没有检测到目的蛋白表达，应该仔细核对转染质粒的测序结果，确保测序结果和读码框完全正确。启动子、复制起始位点、质粒大小都会影响基因表达水平。 i. 如果靶基因的敲减(knockdown)效果欠佳，应该考虑尝试设计不同的siRNA。 2. 出现一定程度的细胞毒性： a. 转染前，细胞至少铺板 18-24 小时。 b. 质粒用量不变，Lipo8000™转染试剂的用量减少 25%。例如通常六孔板每孔使用 2.5μg 质粒，4μl Lipo8000™，如果发现有细胞毒性，六孔板每孔可以尝试使用 2.5μg 质粒，3μl Lipo8000™，此时经测试对于转染效率没有很明显的影响。 c. 减少质粒用量，按照比例减少 Lipo8000™转染试剂；或在前者的基础上 Lipo8000™转染试剂用量再减少 25%。 d. 检查是否转染时细胞密度太低，Lipo8000™转染时细胞密度以 70-80%为佳。 e. 某些细胞对 Lipo8000™转染试剂比较敏感，可以在转染后 4-6 小时更换细胞培养液，转染效率无显著影响。 f. 检查细胞是否有支原体等微生物污染。 附录： 常用多孔板和培养皿的尺寸、培养面积、细胞培养量和推荐的培养体积等相关数据表：

  *Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer, and the listed sizes are from Corning.   **These wells or dishes are square. 相关产品：