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作者：

张吕

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摘要：

本研究主要包括三个方面:一,一株新种细菌鲁杰氏菌Ruegeria kandeliae J95~T的分类鉴定研究;二,双吲哚生物碱类化合物3,3'-二吲哚甲烷(3,3'-diindolylmethane,DIM)的抗污损生物新月菱形藻的作用机理研究;三,抗污损化合物DIM胁迫下污损生物苔藓虫幼虫的转录组学研究.一,一株新种细菌鲁杰氏菌Ruegeria kandeliae J95~T的分类鉴定研究对香港米埔红树林保护区的植物秋茄的根际土壤进行分离与物种鉴定(基于16S rDNA序列),,共得到了27个属61个种的103株已知细菌和3株疑似新菌的未知细菌,并对其中一株新种细菌J95~T进行了新菌鉴定的研究实验.这一结果显示了香港米埔红树林植物根系土壤可培养细菌的物种多样性和新颖性,且可能具有潜在的生物利用价值.对上述分离自香港米埔红树林保护区的秋茄根际土壤中的Ruegeria属的新种菌株J95~T进行了菌落表型,生理生化特征和系统发育的菌种鉴定有关研究.J95~T为一株革兰氏阴性,杆状,能运动的细菌.16S rRNA基因序列的系统发育分析显示菌株J95~T属于Ruegeria属,该菌株16S rDNA序列与其同源性最高的标准菌Ruegeria marina ZH17~T的最高相似度为96.8%.J95~T的基因组包括5,299个基因,含有一个5.48 Mb的环状染色体,DNA的G+C含量为65.7 mol%.菌株J95~T适合的生长条件为pH值5.0-8.5(最适6.0-7.0),10-40℃(最适30-37℃)和NaCl含量0-9%(w/v)(最适0.5-3%).化学分析表明,泛醌-10(Q-10)为主要呼吸醌,C18:1ω7c和C19:0 cycloω8c为主要脂肪酸.主要极性脂为脂质,氨基脂质,磷脂,磷脂酰胆碱,磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺.根据以上表型特征,化学分类学和系统发育分析表明,菌株J95~T是Ruegeria属的一个新种细菌,命名为Ruegeria kandeliae sp.nov.,其标准菌的菌株编号为J95~T.目前该菌株保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心和德国微生物菌种保藏中心,其保藏号分别为MCCC 1K03284~T和DSM 104293~T.二,双吲哚生物碱类化合物3,3'-二吲哚甲烷(3,3'-diindolylmethane,DIM)对污损生物新月菱形藻的作用机理研究双吲哚生物碱类化合物3,3'-二吲哚甲烷(DIM)对污损生物新月菱形藻(Nitzschia closterium)具有良好的抗污损活性,即96 h的EC_(50)值为0.3713μg/mL,EC_(90)值为1μg/mL,NOEC为0.0313μg/mL.本研究通过非损伤微测(Nano Molding Technology,NMT)技术,原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)和X-射线光电子能谱(X-ray Photoelectron Spectroscopy,XPS)对DIM抗污损生物新月菱形藻的作用机理进行了初步探究.使用非损伤微测(NMT)技术原位测量细胞表面的氢离子流量发现,相对于对照组,一定浓度DIM培养的细胞氢离子内流速度降低甚至出现外排现象,产生的原因可能是细胞壁吸收过量的阳离子导致其需要外排H~+来达到平衡,并且可能与细胞液泡中阳离子和内部合成的有机酸阴离子的累积相关.DIM在高浓度时引起Ca~(2+)外排,细胞壁对Ca~(2+)的吸附能力的减弱和细胞内缺少一定量的Ca~(2+),会造成细胞壁合成受阻.通过原子力显微镜(AFM)的粗糙度测量发现DIM可通过增加新月菱形藻细胞壁的粗糙程度来降低细胞壁的完整性,从而使其表面对痕量金属的吸附基团种类和数量变少,杨氏模量测量发现DIM会减弱细胞壁的机械强度来影响其表面吸附能力.X-射线光电子能谱(XPS)结果显示,DIM使细胞壁上占优势的有机配体基团类型和数量发生变化,这为细胞表面不同基团对不同金属离子的吸附能力的差异提供了数据支持.三,抗污损化合物DIM胁迫下污损生物苔藓虫幼虫的转录组学研究.对化合物DIM抗污损生物苔藓虫幼虫的作用机理进行转录组学相关研究.以DIM低浓度组(2μg/mL)和DIM高浓度组(4μg/mL)处理苔藓虫幼虫3小时,应用RNA-Seq技术对对照组,DIM低浓度组和高浓度组处理的苔藓虫幼虫进行测序,利用转录组学技术分析不同浓度的DIM如何影响苔藓虫幼虫的附着和变态.结果显示,3组13个样本共得到686,759,362个原始序列,经过筛选后得到670,566,046个高质量序列,拼接后得到37,159条unigene序列,总大小为43,932,439 bp,最短长度为301 bp,最大长度为27,362 bp,平均长度为1,182 bp.在七大数据库中进行基因功能注释,总共37,159个基因中19,893个(53.53%)基因获得注释.基因差异表达显示,与对照组相比,DIM低浓度组有888个基因表达上调,855个基因表达下调;DIM高浓度组有2,148个基因表达上调,1,876个基因表达下调;DIM高浓度组与DIM低浓度组对比,有990个基因表达上调,591个基因表达下调.以上结果分析表明,DIM通过上调苔藓虫幼虫附着变态过程中与应激性,蛋白质降解,蛋白质翻译和凋亡通路,下调与发育途径和胶原蛋白等相关基因的表达来发挥其抗污损的功能.

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