今天介绍的是乙肝病毒，乙肝病毒是唯一感染人类的拟逆转录病毒(Pararetrovirus)。文中所使用的乙肝病毒毒株是ayw，其cccDNA碱基对数为3182bp。

        乙肝病毒(HBV)是经典肝DNA病毒/经典希巴德那病毒(Orthohepadnavirus)的一种，也属于肝DNA病毒/希巴德那病毒(Hepadnavirus)大家族，该病毒引起乙型肝炎。

        从青铜时代开始，人类就感染了乙肝病毒。最早由乙肝病毒引起的流行病记录是1885年Lurman所创。1883年，不来梅爆发了天花，并为1289名船厂员工接种了其他人的淋巴疫苗。 几周后，直到八个月后，有191名接种疫苗的工人染上了黄疸病，并被诊断出患有血清肝炎。接种了不同批次的淋巴液的其他员工仍保持健康。Lurman的论文现在被视为流行病学研究的经典例子，证明受污染的淋巴野是暴发的根源。 后来，在1909年引入皮下注射针头后，据报道发生了许多类似的暴发，皮下注射针头已被使用，更重要的是，再次用于皮下注射Salvarsan来治疗梅毒。

        有史以来最大的乙型肝炎暴发是在1941年至1942年之间感染了330000美国士兵，导致50000患了黄疸病。出于军事机密，直到1987年才向公众公开。

       该病毒直到1966年才被公开发现。当时，当时在国立卫生研究院（NIH）工作的Baruch Blumberg在澳大利亚原住民的血液中发现了澳大利亚抗原（后来称为乙肝表面抗原或HBsAg）。尽管自1947年Frederick MacCallum发表研究以来一直怀疑有病毒，David Dane和其他人在1970年通过电子显微镜发现了病毒颗粒。1971年，FDA向血液库发布了有史以来第一份血液供应筛查命令。到1980年代初，已经对该病毒的基因组进行了测序。

       1973年，来自苏联的波兰人Wolfgang Szmusness博士与纽约大学的Saul Krugman博士合作开发了疫苗。 克鲁格曼首先在史泰登岛Willowbrook医院对智障儿童进行了安全性测试，随后的一项调查显示，这是可疑医学研究的经常参与者。Szmuness博士曾与铜姓链者健康计划合作，该计划是曼哈顿肉类加工区的一家破旧的慈善机构，在石墙后时代的高度混杂的“铜姓链贫民窟”中，已经发现多达50％的铜姓链者受到了乙肝病毒的感染。这样的“快速”铜姓链者为严格设计疫苗有效性的试验创造了理想的测试人群，并且采取了公共卫生政策以促进涉及10000名男铜姓链者的疫苗实验。

        在旧金山，洛杉矶，丹佛，圣路易斯和芝加哥的同X恋社区中也重复进行了疫苗试验。该疫苗于1981年获得批准，该试验记录是从传统方法鉴定病原体到基于双盲安慰剂对照试验批准疫苗的最快开发疫苗的记录。

        最初的疫苗销售非常缓慢：美国退伍军人管理局预计将向其雇员发放90000剂，但卫生保健工作者只服用了30000剂，他们是职业暴露的主要风险人群。该疫苗是从铜姓链慢性乙肝病毒携带者的血清中生产的，约翰·芬克贝纳博士（John Finkbeiner）于1983年1月警告说，“可能被引起后天免疫机能丧失综合症（AIDS）流行的病原体所污染。”其他人认为，该疫苗可以助长AIDS。1986年，开始研究不使用人血清的第二代疫苗，第一款疫苗于1990年停产。

       除引起肝炎外，HBV感染还可导致肝硬化和肝细胞癌。

       也有人认为它可能会增加胰腺癌的风险。

       乙肝病毒被分类为经典肝DNA病毒/经典希巴德那病毒(Orthohepadnavirus)的类型种，它包含其他三个物种：地松鼠乙肝病毒(Ground squirrel hepatitis virus)、土拨鼠乙肝病毒(Woodchuck hepatitis virus)和卷毛猴乙肝病毒(Woolly monkey hepatitis B virus)。 该属被归类为肝DNA病毒/希巴德那(Hepadnavirus)的一部分，该病毒包含另外一个属——禽希巴德那病毒/禽肝DNA病毒(Avihepadnavirus)。 

        在所有猿类（猩猩，长臂猿，大猩猩和黑猩猩），旧大陆的猴子和新大陆的羊毛猴中都发现了与乙肝病毒相似的病毒，这表明这种病毒起源于灵长类动物。

        根据其包膜蛋白上存在的抗原表位，该病毒分为四种主要血清型（adr，adw，ayr，ayw），根据基因组的总体核苷酸序列变异，分为八种基因型（A～H）。基因型具有独特的地理分布，并用于追踪病毒的进化和传播。 基因型之间的差异会影响疾病的严重程度，病程和并发症的可能性，以及对治疗和疫苗接种的反应。

        已从蝙蝠中分离出许多尚未分类的乙肝病毒样物种。

        乙肝病毒是经典肝DNA病毒/经典希巴德那病毒家族的成员。该病毒颗粒称为Dane颗粒（病毒颗粒），由外部脂质包膜和由蛋白质组成的二十面体核衣壳核心组成。 核衣壳包裹着病毒DNA和一种具有逆转录酶活性的DNA聚合酶，其活性与逆转录病毒相似。外壳包含内嵌的蛋白质，这些蛋白质参与易感细胞的病毒结合和进入。 该病毒是病毒体直径为42 nm的最小的包膜动物病毒之一，但存在多形形式，包括缺少核心的丝状和球形体。 这些颗粒不是传染性的，它们由形成病毒粒子表面一部分的脂质和蛋白质组成，称为表面抗原（HBsAg），在病毒的生命周期中会大量产生。

       HBsAg：乙型肝炎表面抗原（HBsAg）/S蛋白是第一个被发现的乙肝病毒蛋白。它由小（S），中（M）和大（L）蛋白组成。

         HBsAg蛋白具有两种构象：只有三个跨膜区域的Li-HBsAg，和四个跨膜区域的Le-HBsAg。其中，Li-HBsAg作为病毒的基质蛋白，负责病毒在内质网上出芽。Le-HBsAg形成病毒的棘突蛋白，同时为病毒提供保护。

         L-HBsAg的氨基末端含有一个特殊的内质网滞留序列。L-HBsAg在内质网上出芽且会对肝细胞造成伤害，这是造成乙型肝炎的机制之一——另一个是免疫系统的细胞杀伤作用。

        由于HBsAg这一大型棘突蛋白，乙肝病毒的抵抗力比较强，对低温干燥热紫外线以及一般浓度的消毒剂都可以较好的耐受，在37℃下可以存活七天左右。在血清中30到32摄氏度下可以保存六个月。在零下20℃可保存15年。100℃十分钟，65℃十小时，或者高压蒸汽消毒，才能有效杀死乙肝病毒。

       丁肝病毒(Hepatitis Deltavirus/Deltavirus A/DVA)必须依赖乙肝病毒的HBsAg，才能完成出芽。

       幸运的是，乙肝病毒对0.2%的苯扎溴胺以及0.5%的过氧乙酸敏感，可以有效的消除病毒。

        HBcAg：HBcAg（HBeAg是剪接变体）/C蛋白是HBV二十面体核衣壳的主要结构蛋白，在病毒复制中具有功能。乙肝病毒抗原（HBcAg）的衣壳形成是细胞感染的主要因素。HBcAg有助于体内HBV清除，但尚不清楚HBcAg是否必须呈衣壳形式才能促进病毒清除。

        P蛋白：乙肝病毒DNA聚合酶，其精确度只是比HIV略高一点，有文献为证。

       英文文献：The fidelity of HBV-Pol was investigated and compared with that of HIV‐1 RT, which is highly error‐prone. The fidelity of HBV polymerase seems to be achieved by increasing the Km for the dNTP being misinserted. The nucleotide misinsertion efficiency of HBV-Pol and HIV‐1 RT ranged from 3.59×10^−4 (C:T) to 1.51×10^−3 (G:T) and from 1.75×10^−4 (C:T) to 1.62×10^−3 (G:T), respectively, and the overall misinsertion efficiency of HIV‐1 RT was just 1.04‐fold higher than that of HBV-Pol, implying that HBV polymerase is fairly error‐prone.

        大体意思是：对乙肝病毒DNA聚合酶的保真度进行了研究，并将其与HIV-1逆转录酶的保真度进行了比较，相比乙肝病毒DNA聚合酶，HIV-1逆转录酶极易出错。乙肝病毒DNA聚合酶的保真度似乎是通过增加错配的dNTP的Km{米氏常数，酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同的酶Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可近似的反映酶与底物的亲和力大小：Km值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲合力大。米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])，[S]表示底物浓度，Vmax表示最大酶促反应速度。}来实现的。乙肝病毒DNA聚合酶的核苷酸错配率范围为3.59×10^-4(C：T)至1.51×10^-3(G：T)，HIV-1逆转录酶的核苷酸错配率为1.75×10^-4(C：T)至1.62×10^-3(G：T)，HIV-1逆转录酶的总体错配率仅比乙肝病毒DNA聚合酶高1.04倍，这意味着HBV聚合酶相当容易出错。

       虽然人们已经创造出了乙肝病毒假病毒载体，但是很少使用。主要的原因就是乙肝病毒的大表面抗原会堆积在内质网上，引发细胞病变。

        HBx：乙型肝炎病毒蛋白HBx/X蛋白很小，仅有154个氨基酸长，是非结构蛋白，在HBV相关肝病和HepG2细胞中HBV复制中具有重要作用。 许多活动与HBx的表达有关。 然而，许多这些活性的分子机制尚不清楚。该蛋白具有多功能性，可激活细胞信号传导途径，对于病毒感染至关重要。

       丁肝病毒必须依赖乙肝病毒表面抗原才能有感染性。有关丁肝病毒的文章，请参阅CV6173028。

        像所有病毒一样，乙肝病毒的早期进化很难确定。

         经典肝DNA病毒/经典希巴德那病毒和禽肝DNA病毒/禽希巴德那病毒的发散发生在大约125000年前(95％的区间为78297-313500)。大约2.5万年前，禽希巴德那病毒和经典希巴德那病毒都开始多样化。此时的分支导致了希巴德那基因型A–H的出现。 人类毒株的最新祖先可以追溯到7000年前(95％区间：5287–9270)至10000(95％区间：6305–16681)年前。

         鸭乙肝病毒缺乏X蛋白，但是鸭乙肝病毒的基因组中存在残留的X阅读框。X蛋白可能已经从DNA糖基化酶进化而来。

        据估计，这种病毒的非同义突变的发生率约为每个位点每年2×10^-5个氨基酸置换。核苷酸取代的平均数量/位点/年为7.9×10^-5。

        对这种病毒起源的第二个估计表明，这是约1500年前进化出的人类毒株的最新共同祖先。禽品系的最新共同祖先是在6000年前。 突变率估计为10^-6个替换/位点/年。

        另一项具有较大数据集的分析表明，33600年前感染了乙型肝炎的人(22000-47100年前)密度增加了95％，估计的替代率为2.2×10^-6个替代/位点/年。在过去的5000年中，该种群的数量有所增加；在最近的6100年中，猩猩和长臂猿的跨物种感染发生了。

        对斑马雀乙肝病毒的序列的研究至少将这一属的起源推到了4000万年前，甚至可能推到了8000万年前。黑猩猩，大猩猩，猩猩和长臂猿物种与人类分离株成簇。非灵长类动物包括土拨鼠乙肝病毒，地松鼠乙肝病毒和北极松鼠乙肝病毒。此外，还发现了许多蝙蝠感染物种。 有人提出，新世界蝙蝠物种可能是灵长类物种的起源。

        一项关于来自北极人群的分离株的研究表明，B5亚基因型的祖先(在该种群中发现的特有类型)祖传病毒起源于大约2000年前的亚洲(95％HPD 900.B.C.-830.A.D.)。合并发生在公元1000年左右。 这种亚型最初从亚洲传播到格陵兰，然后在最近的400年中向西传播。

        乙型肝炎感染的最早证据可追溯到青铜时代。该证据是从4500年前的人类遗骸中获得的。根据2018年的研究，通过S.H.O.T.G.U.N.测序获得的病毒基因组成为了从脊椎动物样品中回收的最古老的基因。还发现一些古老的肝炎病毒株仍然感染人类，而另一些则已灭绝。这证明了乙型肝炎起源于新世界并在16世纪左右传播到欧洲的观点。

       HBV的基因组由环状DNA组成，但该DNA并非完全双链。 全长链的一端与病毒DNA聚合酶连接。 基因组长3020-3320个核苷酸(全长链)和1700-2800个核苷酸(短链)。

       反义链与病毒mRNA互补。 感染细胞后不久便在细胞核中发现了病毒DNA。 通过细胞DNA聚合酶完成正义链的形成，使部分双链DNA完全变成双链——病毒DNA聚合酶用于后期），从反义DNA去除病毒聚合酶蛋白(P)、正义DNA的RNA短序列，从反义DNA的末端去除非编码碱基，并重新连接末端。

         病毒基因通过细胞RNA聚合酶II从共价闭合的环状DNA（cccDNA）模板转录到细胞核中。 在HBV基因组中已鉴定出两个称为增强子I（EnhI）和增强子II（EnhII）的增强子。 两种增强子在肝起源细胞中均表现出更高的活性，并共同驱动和调节完整病毒转录本的表达。

        由基因组编码的四个已知基因称为C，P，S和X。核心蛋白由基因C（HBcAg）编码，其起始密码子之前是上游框内AUG起始密码子， 产生前核心蛋白。HBeAg是通过蛋白水解加工前核心蛋白而产生的。DNA聚合酶由基因P编码。基因S是编码表面抗原（HBsAg）的基因。  HBsAg基因是一个较长的开放阅读框，但包含三个框内的“起始”（ATG）密码子，可将基因分为三个部分，即前S1，前S2和S。由于存在多个起始密码子，因此三个多肽产生了不同的大小，称为大，中和小（pre-S1+pre-S2+S，pre-S2+S和S）。基因X编码的蛋白质的功能尚未完全了解，但有证据表明它可能起转录反式激活因子的作用。

      HBV基因组中已鉴定出几种非编码RNA元件。 其中包括：HBV PREα，HBV PREβ和HBV RNA包装信号ε。包装信号ε可以诱导病毒DNA聚合酶与正义RNA结合，并且在泡泡区形成起始引物。

        HBV各个基因型至少相差8％，且具有独特的地理分布，这与人类学历史有关。 在基因型中，已经描述了亚型：它们之间的差异为基因组的4–8％。

        有8种已知的基因型，记为A至H。已经描述了一种可能的新“I”基因型，但这种表示法的接受并不普遍。

        此后，又发现了另外两种基因型。当前（2014年）的列表现在从A到J进行排序。还可以识别几种子类型。

       HBV至少有24个亚型，不同的基因型可能以不同的方式对治疗产生反应。

        与其他基因组差异达14％的F型是已知最分歧的类型。 A型流行于欧洲、非洲和东南亚，包括菲律宾。 B型和C型在亚洲占主导地位。  D型在地中海地区，中东和印度很常见； E型位于撒哈拉以南非洲； F型(或H型)仅限于中美洲和南美洲。 在法国和德国发现了G型。 基因型A，D和F在巴西占主导地位，所有基因型在美国均以依赖种族的频率出现。E和F株似乎分别起源于非洲和新世界的原住民。

       A型具有两个子类型：非洲、亚洲和菲律宾的Aa(A1)和欧洲、美国的Ae(A2)。

       B型具有两个不同的地理分布：Bj / B1(“j”-日本)和Ba / B2(“a”-亚洲)。Ba类型进一步细分为四个进化枝(B2-B4)。

       C型具有两种地理亚型：东南亚的Cs(C1)和东亚的Ce(C2)。C亚型被分为五个进化枝(C1-C5)。菲律宾已经描述了第六支进化枝(C6)，但迄今为止仅分离出一种。越南、缅甸和泰国为C1型；日本、韩国和華夏为C2型； 新喀里多尼亚和波利尼西亚的C3型；澳大利亚为C4型；菲律宾为C5型。印度尼西亚的巴布亚描述了另一种亚型。

        D型已分为7个子类型(D1-D7)。

       F型已细分为4个子类型(F1-F4)。F1已进一步分为1a和1b。 在委内瑞拉、东、西美洲印第安人中都发现亚型F1、F2和F3。 在南美洲印第安人中，只有F3被发现。 亚型Ia，III和IV的地理分布有限(分别位于中美洲、南美洲的北部和南部)，而Ib和II进化枝分别在除南美北部和北美以外的所有美洲发现。

        乙肝病毒的生命周期很复杂，乙肝病毒是少数几种使用逆转录作为复制过程一部分的非逆转录病毒之一——另一个是花椰菜花叶病毒(Cauliflower Mosaic Virus)，它们被称为拟逆转录病毒(Pararetrovirus)。

1.病毒通过与细胞表面的受体结合并通过网格蛋白或caveolin-1介导的内吞作用进入细胞。HBV最初与硫酸肝素蛋白聚糖结合。 然后，HBV L蛋白的前S1片段与SLC10A1基因编码的细胞表面受体牛磺酸钠共转运多肽(NTCP)紧密结合。NTCP主要存在于肝细胞的正弦膜中。 肝细胞中NTCP的存在与HBV感染的组织特异性有关。

2.内吞后，病毒膜与宿主细胞膜融合，将核衣壳释放到细胞质中。

3.因为病毒通过宿主酶产生的RNA繁殖，所以病毒基因组DNA必须转移到细胞核中。 认为衣壳在微管上被运输到核孔。核心蛋白从部分双链病毒DNA解离，然后被制成全双链(通过宿主DNA聚合酶)并转化为共价闭合的环状DNA(cccDNA)，用作四个病毒mRNA转录的模板。

4.最长的mRNA(比病毒基因组更长)被用于制造基因组的新副本，以及制备衣壳核心蛋白和病毒依赖RNA的DNA聚合酶。

5.这四个病毒转录本经过额外的处理，然后继续形成子代病毒体，该子体从细胞中释放或返回细胞核，然后循环以产生更多拷贝。

6.最长的mRNA被转运回细胞质，在此病毒粒子P蛋白通过其逆转录酶活性合成DNA。

7.当病毒的部分双链DNA合成完成时，核心蛋白将部分双链DNA包裹成球体，球体在内质网高尔基体出芽。

       乙肝病毒(HBV)基因组含有4个ORF，编码聚合酶(P)、核心(C)、表面(S)，以及X四种蛋白。这四种HBV的mRNA起源于不同的启动子，但具有共同的3'末端。尽管HBV存在拼接的RNA，但它的主要蛋白却是由未拼接的RNA翻译。这些未拼接的转录体中都含有一个能够促进HBV转录体核输出的顺式作用的RNA元件，即HBV转录后调节元件(HPRE)。HPRE与增强子I部分重叠，是HBV表面蛋白mRNA细胞浆定位所必需的。在功能上，HPRE类似于慢病毒的Rev-RRE(Rev反应元件)的作用。在Rev-RRE依赖性质粒构建体中，HPRE可以替代HIV-1的Rev-RRE复合物的作用。此外，HPRE在功能上也可以替代内含子的作用。

        有极小的概率，以乙肝病毒为首的拟逆转录病毒会逆转录出丝状DNA/dlDNA，而不是开放环状DNA/rcDNA，逆转录病毒会有极小的概率，逆转录出环状DNA，泡沫病毒有20％概率包装dsDNA片段。这充分证明，世界上所有的真核细胞、细菌、真菌、dsDNA病毒和ssDNA病毒很可能是由拟逆转录病毒进化而来，而拟逆转录病毒很可能是由逆转录病毒进化而来。