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作者：

瞿城

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摘要：

本论文研究工作为国家自然科学基金项目—"丹参-红花配伍活血化瘀功效物质与协同增效相互作用研究"(81573714)和江苏省"333高层次人才培养工程"项目(BRA2016387)中的部分研究内容。论文共分为四章,具体的研究内容与实验结果如下:第一章文献研究第一节活血化瘀药对的研究进展本文系统综述了活血化瘀药对的配伍规律,为后期活血化瘀药对配伍效应与物质基础研究奠定理论基础。第二节丹参-红花配伍研究进展本文系统综述了丹参-红花配伍的制剂应用,化学成分,药代动力学、药理作用和系统生物学研究。第二章丹参-红花药对配伍效应物质基础研究第一节药材采集与样品制备称取丹参、红花及其药对(3:1)药材各5 kg,进行热回流水提取,分别得到丹参、红花和丹参-红花样品,冷藏备用。第二节基于"化学模糊识别"策略的丹参-红花配伍化学成分变化规律研究采用HPLC-PDA技术和"化学模糊识别"策略对丹参-红花药对不同配比的活性物质变化规律进行了系统研究。通过建立丹参与红花的化学物质库,并经过对照品峰的紫外信息,建立了四类活性物质(丹酚酸类,丹参酮类、醌式查尔酮类和黄酮类)的紫外信号网络,并通过网络将丹参-红花中的成分进行快速鉴别与归类,进而通过对称配比设计对这些化合物进行定量分析。在丹参-红花配伍的水煎液中,通过"化学模糊识别"策略分别鉴定出47个成分,其中,15个丹酚酸类成分,20个醌式查尔酮类成分,12个黄酮类成分。不同配比中,在5:1~5:2的范围内所测成分总的相对溶出度较高,总的相对溶出度最高时丹参、红花配比为5:2。结果表明不同配伍比例的丹参-红花中不同化学成分的配伍变化规律有所不同,且存在较优配比,为丹参-红花药对临床配伍合理应用提供了参考,为药对现代基础研究提供了思路与方法。第三节基于UHPLC-TQ/MS技术的丹参-红花配伍前后主要效应成分变化研究本实验首次建立了一种13分钟内快速有效的同时测定丹参-红花药对及其单味药中15个活性成分(酚酸和黄酮类)含量的超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法(UHPLC-TQ/MS)。该方法具有良好的线性(r2>0.9975),检测限(1.12~7.01ngmL-1),定量限(3.73~23.37ngmL-1),精密度(RSD≤1.92%,RSD≤2.45%),稳定性(RSD≤≤5.63%),重复性(RSD≤ 4.34%),回收率(96.84%~102.12%)和基质效应(0.92~1.02)。用该方法比较评价丹参、红花配伍前后主要活性成分含量变化发现,与单味药相比,丹参素、6-羟基山奈酚-3-O-芸香糖苷-6-O-葡萄糖苷、原儿茶醛、咖啡酸、芦丁、脱水红花黄色B、山奈酚-3-O-芸香糖苷和山奈酚含量配伍后显著增加,增加率分别为45.24%、14.12%、21.68%、86.00%、31.62%、4.63%、19.73%和56.60%。丹参、红花配伍前后活性成分含量的变化可能是引起药对协同增效作用的一个重要因素。该方法为丹参-红花药对的质量控制和药物相互作用研究提供了理论基础和参考。第三章丹参-红花活血化瘀配伍效应研究第一节丹参-红花体外活血化瘀量效关系研究本实验基于体外抗氧化(DPPH、ABTS、OH·自由基清除法及FRAP法)、抑制血小板聚集(ADP)和抗凝血(TT、PT、APTT、FIB)活性评价,比较研究丹参-红花配伍前后活血化瘀效应。结果表明,丹参、红花和丹参-红花药对DPPH和ABTS的IC50分别102.00、61.61、60.36mgL-1和33.82、26.85、23.99mgL-1,各剂量组对Fe3+有较强的还原作用,呈现一定的量效关系;与空白组比较,除丹参低剂量组(0.031 gmL-1)外,其他各组对ADP诱导的血小板聚集率有显著降低作用,呈现一定的量效关系;丹参、红花和丹参-红花药对高剂量组(0.250、0.500、1.000 g mL-1)对TT均有显著延长作用,且丹参-红花药对优于单味药;丹参-红花药对各剂量组对PT具有显著延长作用;丹参、红花配伍前后各剂量组对APTT均有显著延长作用,且呈现一定的量效关系;同时,丹参-红花药对各剂量组显著降低家兔血浆中FIB含量。综合分析发现,丹参-红花药对及其单味药均有显著地抗氧化、抑制血小板聚集和抗凝血作用,丹参、红花配伍后活血化瘀效应有所增强,体现出一定的协同增效作用。第二节不同动物模型的丹参-红花药对活血化瘀量效关系比较研究本实验采用急性血瘀和心肌缺血大鼠模型,观察不同剂量丹参-红花药对活血化瘀效应。通过测定全血黏度(WBV)、血浆黏度(PV)、血沉(ESR),红细胞压积(HCT),凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶时间(APTT)、血浆纤维蛋白原(FIB)含量及血小板最大聚集率(ADP)观察不同剂量丹参-红花药对对急性血瘀大鼠血液流变学,凝血功能及血小板聚集指标的影响。结果表明,与空白组比较,模型组大鼠血液流变学和凝血功能及血小板聚集指标均有显著性差异;与模型组比较,丹参-红花药对低、中、高3个剂量给药组均能较好地改善血瘀大鼠的血液流变学、凝血功能异常和血小板聚集,并呈一定的量效关系,最优的给药剂量为7.20 g kg-1。通过测定肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、前列环素(PGI2)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血栓素B2(TXB2)、6-酮前列腺素(6-Keto-PGF1α)、ATP酶和ATP含量观察不同剂量丹参-红花药对(DH-1、3、5、10倍量)对急性心肌缺血大鼠的保护作用。结果表明,不同剂量丹参-红花药对急性心肌缺血大鼠的心肌酶、氧化水平、血管内皮功能、炎症反应、血小板聚集和能量代谢异常具有保护改善作用,不同剂量组活血化瘀作用的大小顺序为:DH-5>DH-10>DH-3>DH-1,最优的给药剂量为丹参-红花药对药典5倍量(9 gkg-1),同时优选急性心肌缺血模型为后期整体动物模型。第三节基于急性心肌缺血模型大鼠的丹参-红花活血化瘀配伍效应评价本实验在前期丹参-红花药对活血化瘀量-效关系研究的基础上,基于急性心肌缺血大鼠模型,通过测定心脏系数、肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、肌酸激酶(CK)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)比较研究丹参、红花配伍前后活血化瘀效应变化。结果表明,丹参、红花及其药对能够明显改善异丙肾上腺素导致的心脏系数、肌钙蛋白Ⅰ、心肌酶异常,部分调节大鼠体内脂质过氧化物的水平和清除氧自由基的能力,显著改善ET-1和NO水平。进一步将各给药组的药效数据经过主成分分析(PCA),采用各给药组到空白组的相对距离法来比较活血化瘀效应。各给药组的活血化瘀作用的大小顺序为:丹参-红花>红花>丹参。除MDA水平外,丹参、红花配伍对急性心肌缺血具有活血化瘀协同作用,可能与其降低肌钙蛋白Ⅰ、心肌酶含量,抑制脂质过氧化和保护血管内皮细胞功能有关;通过整合效应成分含量变化后发现,活性成分丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸B可能是丹参-红花配伍效应的物质,具体机制有待进一步深入研究。第四章丹参-红花配伍活血化瘀协同增效机制研究第一节丹参-红花药对在正常和急性心肌缺血模型大鼠体内的药动学比较研究本实验基于正常和异丙肾上腺素诱导大鼠急性心肌缺血模型,建立丹参中9个效应成分在大鼠血浆中的UHPLC-MS/MS的测定方法,比较评价丹参中主要效应成分配伍前后在正常和急性心肌缺血模型中的药动学参数的变化,最终揭示丹参、红花配伍活血化瘀效应的潜在物质基础。结果表明,9个效应成分在血浆中的具有良好的线性关系(r2≥0.9958),日内和日间精密度分别小于11.53%和12.72%,准确度相对误差在±10.88%范围内,回收率和基质效应分别小于11.30%和10.36%。丹参、丹参-红花单剂量灌胃给药9gkg-1后,丹参中主要效应成分的半衰期较短,且在8小时内消除达90%。与单味药组相比,除丹参素的T1/2显著延长外,丹参中主要效应成分在配伍红花后,药动学行为变化差异不明显;与正常组相比,模型组大鼠体内的原儿茶醛和咖啡酸T1/2、丹参素Tmax显著延长,丹参各效应成分药动学参数Cmax、AUC0-t和AUC0-∞显著增加,提示丹酚酸类成分可能跟丹参-红花药对改善心肌缺血损伤密切相关。第二节基于代谢组学的丹参-红花配伍活血化瘀效应机制研究采用异丙肾上腺素诱导复制大鼠急性心肌缺血模型,基于代谢组学研究丹参-红花配伍活血化瘀效应机制。首先,通过血清肌钙蛋白Ⅰ、心肌酶和氧化水平指标(cTnI、CK、AST、LDH、MDA、SOD)检测,评价比较丹参、红花及其药对对急性心肌缺血大鼠的心肌损伤保护作用;结果表明,与正常组比较,模型组大鼠血清中肌钙蛋白Ⅰ、心肌酶和氧化水平显著变化(P