1 样本量的法规要求

国家食品药品监督管理总局在2005年颁布的《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》中要求:“受试者例数应当符合统计学要求，对于目前的统计方法，18～24例可满足大多数药物对样本量的要求，但对某些变异性大的药物可能需要适当增加例数”。《中华人民共和国药典》2015年版《药物制剂生物利用度和生物等效性指导原则》(草案)指出:“在一项生物等效性试验中，可评价的受试者数目不应少于18名”。

WHO2006年在“Multisource(generic) pharma-ceutical products:guidelines on registration requirements to establish interchangeability”中要求:样本量应根据统计学要求和生物等效性接受标准合理计算，最少为12例。

美国2003年在“Guidance for industry，bioavail-ability and bioequivalence studies for orally adminis-tered drug products-general considerations”中建议:受试者的总数应提供足够的把握度获得生物等效的结论。

欧盟2010年在“Guideline on the investigation of bioequivalence”要求:纳入受试者例数应基于合适的样本量计算，可评价的受试者例数不少于12例。

加拿大2012年在“Guidance document，Conduct and analysis of comparative bioavailability studies”中要求:确定样本量应考虑试验目的、试验设计、试验用药和试验条件;样本量应符合统计学要求，其第I类错误的概率不超过5%;受试者最少为12例，通常需要更多的受试者。

日本2012年在仿制药生物等效性研究的指导原则中指出:应纳入足够受试者进行生物等效性评价;如受试者例数不足而不能获得生物等效的结论，可追加受试者，追加受试者的例数不应少于原试验例数的一半。

总之，以上国家、地区或国际组织均强调样本量应符合统计学要求，但对最低样本量的要求是不同的。

2 样本量的影响因素

2.1 试验设计类型

试验设计类型是确定样本量的前提，其中包括交叉试验、平行试验、序贯设计试验、重复设计试验(又分半重复和全重复试验)等;另外，还应考虑试验中心个数、给药次数等问题。

2.2 生物等效判断标准

一般情况下，生物等效判断标准为受试制剂与参比制剂的检验指标(Cmax和AUC)几何均数比值(geo-metricmeanratio，GMR)的90%置信区间(90%CI)落在80.00%～125.00%内。对于治疗指数小的药品，可缩窄判断标准，取90.00%～111.11%。对于高变异药品AUC和(或)Cmax，可放宽判断标准，但要有充足理由，并在试验方案中事先规定。

2.3 估算样本量的参数

在明确了试验设计类型和生物等效判断标准的前提下，样本量取决于:显著性水平、把握度、变异度和差别。

2.3.1 显著性水平

显著性水平即α值的大小，通常取0.05。在序贯设计、2阶段的生物等效性试验中，如果追加(add-on)受试者例数，应减小α值，α值可为0.0294或0.028。

2.3.2 把握度

把握度也称检验效能，一般不小于80%，相当于犯第Ⅱ类错误的概率(β)小于20%。在生物等效性试验中，第Ⅱ类错误是将具有生物等效性的制剂错误地判断为不具有生物等效性的制剂;第Ⅰ类错误则是将不具有生物等效性的制剂错误地判断为具有生物等效性的制剂。

2.3.3 变异度

变异度是指检验指标的变异程度，以σ表示。在经典的2×2交叉设计的生物等效性试验中，σ即为药动学参数经对数转化后进行方差分析得到的均方差根(root means quare error，RMSE)，σ可以换算成个体内变异系数(within-subject CV，CVw);在平行设计的生物等效性试验中，σ包括药动学参数的个体间变异和个体内变异。σ可以根据已有文献资料或预试验确定或估算。作者查看已有文献中很少报告σ或CVw，但可以根据受试制剂与参比制剂药动学参数GMR的90%CI宽窄粗略估算。

2.3.4 差别

差别是指检验指标的差别，以θ表示，θ=μT－μR，μT和μR分别为受试制剂与参比制剂检验指标的总体均值。在生物等效性试验中，差别是指受试制剂与参比制剂药动学参数的差别，通常以GMR代表。GMR取值主要根据受试制剂与参比制剂的实际差别和变异系数大小确定，通常取0.95(或1.05)，变异系数较大时可取0.90(或1.10)。

3 样本量的计算和估计

在上述影响因素确定后，采用PASS，nQuery，S+和SAS等软件计算生物等效性试验的样本量。相关文献还列表给出了不同试验设计(平行或交叉)、不同数据类型(原数据或对数转化后数据)、不同把握度(80%或90%)、不同θ'值(θ'=log(μT/μR)，|θ'|=0～15%)、不同变异度(σ=10%～40%)下生物等效性试验所需要的样本量。对于高变异药品，尤其是变异系数大于40%的药品，应进行半重复或全重复、参比制剂校正的平均生物等效性(reference-scaled average bioequivalence，RSABE)试验，样本量估计可参考相关文献。值得注意的是，计算结果为纳入生物等效性评价的样本量，应考虑到试验中受试者脱落的可能性，一般需要筛选适当多一些的受试者入组试验。

很多情况下，并不知道或确定变异度、差别，因此很难准确计算样本量，在试验方案中可以有追加样本量的考虑。本实验室根据国外相关文献，采用序贯设计、2阶段平均生物等效性试验的方法，即首先依据第1阶段的试验结果，α取值为0.05，进行生物等效性评价。如果(1－β)≥80%，则不需要追加受试者例数进行试验。如果(1－β)＜80%，则α取值为0.029 4(GMR=0.95)或0.028(GMR=0.90)，再次进行生物等效性评价，如果结果符合生物等效性的判断标准，则不需要追加受试者例数进行试验;如果结果不符合生物等效性的判断标准，且不能判断受试制剂与参比制剂具有生物等效性，则α取值为0.029 4(GMR=0.95)或0.028(GMR=0.90)，根据第1阶段的试验结果估算样本量，追加受试者例数进行试验，合并2个阶段的数据，α取值为0.029 4(GMR=0.95)或0.028(GMR=0.90)，进行生物等效性评价。

4 样本量的改变

药物制剂生物等效性试验过程中，不可避免会有受试者脱落。一旦发生受试者脱落，不可随意补充受试者;如果因受试者脱落而使试验结论的把握度小于80%，可考虑追加受试者例数，但应在试验方案中事先规定。

统计分析之前，可以剔除少数受试者，但必须在试验方案有事先规定或相关标准操作规程中有相关描述。通常可以剔除以下受试者:符合试验方案的剔除标准者;交叉试验中一个或多个周期未用药或无生物样本测定结果者;口服药物制剂后在吸收相时间内发生呕吐者;口服药物制剂后第1个采血点达峰，且在5～15min内没有采血者。

统计分析之后，不能改变样本量再进行统计，必要时可追加样本量再进行试验和统计分析(详见“3样本量的计算和估计”中的相关描述)。

5 样本量对试验结果的影响

样本量的大小与GMR的(1-2α)置信区间(一般为90%CI)成负相关，一项生物等效性试验因样本量不同可能产生以下4种试验结果:

①样本量足够，GMR的(1-2α)置信区间(一般为90%CI)完全落在规定的范围内(一般为80.00%～125.00%)，结果为可以判断为生物等效。

②样本量足够，GMR的(1-2α)置信区间完全不在规定的范围内，结果为可以判断为生物不等效。

③样本量不足，GMR的(1-2α)置信区间大部分在规定的范围内，结果为不能判断为生物等效。

④样本量不足，GMR的(1-2α)置信区间大部分不在规定的范围内，结果为不能判断为生物不等效。

6 确定样本量的建议

根据国内外的指导原则和相关研究进展，结合相关试验经验和研究结果，本实验室建议(仅代表本文作者的观点)药物制剂生物等效性试验:

①根据试验设计类型、生物等效判断标准和相关统计学要求，采用合适的方法确定样本量。

②2×2交叉设计的生物等效性试验的可评价受试者不应少于12例;高变异药品半重复或全重复、参比制剂校正的生物等效性试验的可评价受试者不应少于24例。

③考虑到受试者脱落等因素，应筛选合适的受试者入组试验。受试者的剔除和追加必须有充分理由，并在试验方案或相关标准操作规程中事先明确。

7 实例简介

本实验室曾开展高变异药品生物等效性的相关理论研究，并完成了阿戈美拉汀片、阿托伐他汀片、泮托拉唑肠溶片等多个高变异药品的生物等效性试验。其中，阿戈美拉汀片的个体内、个体间变异系数都很高，Cmax个体内变异系数高达80%以上，如果采用经典的2×2交叉设计的生物等效性试验方法，需要样本量在200例以上。如果采用半重复、全重复，参比制剂校正的生物等效性试验方法，样本量仅需为36～48例，即可评价受试制剂与参比制剂是否具有生物等效性。

本实验室也曾开展左乙拉西坦片、特拉唑嗪片等个体内、个体间变异系数都很低的药品的生物等效性试验，探讨了不同样本量对统计分析结果和试验结果的影响。左乙拉西坦为生物药剂学分类系统(BCS)第一类的药物，其片剂Cmax和AUC的个体内变异系数分别小于15%和5%，采用经典的2×2交叉设计的生物等效性试验方法，当样本量为12例时，即可判断受试制剂与参比制剂具有生物等效性(把握度＞97%);当样本量继续增加时，结果不变，把握度无明显改变，但方差分析的结果容易出现有统计学意义的周期间差异和/或序列间差异。这个实例说明，样本量过大没有意义。

参考文献（略）

【来源：中国新药杂志 2015年 第24卷第23期】

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