丙型肝炎（丙肝）是一种由HCV引起的主要经血液传播、以肝损害为主的疾病。发病隐匿，临床症状不典型，慢性化程度高。HCV感染呈全球流行，不同性别、年龄、种族的人群均易感，尚无预防性疫苗[1]。WHO在2017年全球肝炎报告中指出，据2015年估计全球有7 100万慢性HCV感染者[2]。我国于2006年结合全国乙型肝炎血清流行病学调查，开展了丙肝血清学研究，结果显示1~59岁人群抗-HCV流行率为0.43%[3]。2016年Petruzziello等[4]对138个国家（约占全球人口90%）在2000-2015年报告数据进行Meta分析，显示我国抗-HCV阳性率为1.3%。为消除作为公共卫生威胁的病毒性肝炎，世界卫生大会批准通过了2016- 2021年全球卫生部门病毒性肝炎战略目标[5]，旨在2030年诊断出90%的感染者，其中80%的患者被治疗。为早日实现该目标，须依靠及时准确的实验室检测方法和有效可行的检测策略。

《丙型肝炎诊断（WS213-2018）》指出，诊断HCV感染的方法主要为抗-HCV和HCV RNA[6]。其中抗-HCV检测包括ELISA、化学发光法试验、胶体金法快速试验等；核酸检测包括RT-PCR、荧光定量PCR（FQ-PCR）等。《丙型肝炎防治指南（2019年版）》将抗-HCV检测用于HCV感染者的筛查，对于抗体阳性者进行核酸检测[7]。若不能及时进行核酸检测，HCV核心抗原可作为HCV RNA用于诊断急性或慢性HCV感染的替代标志物[6-7]。由于单纯进行抗体检测，在不同患者中可能出现假阳性或假阴性结果。《丙型肝炎病毒实验室检测技术规范》（试行）指出，初筛试验中抗体阳性的样本，须做复检试验[8]。若复检结果均为阳性或者一阴一阳反应，还需进行免疫印迹试验或核酸定性检测[8]。与之相比，WHO在2018年《慢性丙型肝炎病毒感染患者的护理和治疗指南》中，对于抗体阳性者进行核酸检测（定性或定量检测）或核心抗原检测的补充试验[9]。美国CDC在2013年更新版指南中则建议对有抗体反应性患者直接进行核酸检测[10]。本文主要介绍目前用于临床诊断的HCV RNA检测方法，核酸检测试剂性能评价以及检测策略。

HCV RNA检测包括定性和定量检测，前者可用于献血员筛查和临床诊断，而后者主要用于进行抗病毒治疗监测及预后判断。目前，已注册试剂采用的检测方法有转录介导扩增技术（TMA）、RT-PCR、分支DNA（bDNA）技术和实时荧光定量PCR技术（Real-time quantative RCR，RT-qPCR）。

1. HCV RNA定性检测：

（1）TMA：利用RNA聚合酶和反转录酶共同作用，对目的基因进行恒温扩增。分析时间短，反应条件简单，无需专门的热循环仪[11]，且采用单管反应，交叉污染风险低，假阳性结果的可能性也非常低[12]。利用TMA进行的核酸检测灵敏度较高，如Versant HCV RNA Qualitative Assay对HCV 1型的分析灵敏度达5.3 IU/ml[13]。

（2）RT-PCR：用于HCV核酸定性和定量检测，其中AMPLICOR HCV Test，v2.0定性检测的最低检测限为50 IU/ml[14]，可作为一种高敏感和准确的方法用于HCV的诊断以及疗效监测[15]。

2. HCV RNA定量检测：

HCV RNA定量检测方法有定量RT-PCR、bDNA技术和RT-qPCR技术。由于定量RT-PCR检测繁琐、易污染，逐渐被其他方法替代。bDNA扩增技术通过信号放大来提高检测的灵敏度[16]，但不如RT-qPCR。RT-qPCR通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行实时监测[17]。随着更多的RT-qPCR出现，定性检测居于次要地位[18-19]，如COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Test，v2.0（CAP/CTM v2.0）最低检测限为15 IU/ml，比定性检测COBAS AMPLICOR HCV v2.0（最低检测限为60 IU/ml）的灵敏度高。此外，定量检测能明确病毒载量，更适合于疗效观察[20]。

1.美国用于临床诊断的HCV RNA检测试剂性能评价：目前，获得美国食品药品管理局（FDA）批准且用于临床诊断HCV RNA的试剂有9种（表 1），其中7种可用于确认HCV感染，包括3种定性检测与4种同时进行定性和定量检测的试剂。这7种检测试剂均不可用于血液筛查，仅供体外诊断使用，且均适用于抗-HCV阳性且有肝病证据者、抗体阳性怀疑有活动性HCV感染或有感染HCV风险者，检测结果不能区分急、慢性感染。若检出HCV RNA提示病毒正在复制，作为活动性HCV感染证据，但HCV RNA阴性结果不能排除活动性HCV感染。此外，定性检测结果不提示有肝病，对于没有HCV感染的抗体证据（未检测、抗-HCV酶免疫分析无反应、抗-HCV条带免疫分析阴性）的患者，应谨慎解释其阳性结果。HCV RNA定性检测试剂中AMPLICOR HCV Test，v2.0的最低检测限为50 IU/ml[21]，而基于TMA的Versant HCV RNA Qualitative Assay具有更高灵敏度，其最低检测限为5.3 IU/ml[22]，该值与Krajden等[23]报告的6.0 IU/ml或Ross等[24]报道的5 IU/ml差异无统计学意义。

定量检测作为管理抗病毒治疗HCV患者的辅助手段，用于测定基线和治疗期间HCV RNA水平，并可用于疗效观察，其检测结果的解释必须结合临床和实验室结果。定量检测不可用于血液筛查，也不用于诊断或确认HCV感染，其中Versant HCV RNA 3.0试剂检测结果的阳性预测值不可用于指导治疗。作为定量检测的Abbott Realtime HCV Assay与CAP/CTM v2.0性能相当，比Versant HCV RNA 3.0具有更好的性能[25]。同时，CAP/CTM v2.0与FDA批准的定性、定量检测的试剂之间有强相关性[26-27]。

Vermehren等[28]对4种不同平台的罗氏HCV RNA检测的分析和临床性能进行多中心比较研究，结果表明COBAS HCV 6800/8800与CAP/CTM v2.0检测之间具有较好的相关性。除COBAS HCV 6800/8800检测之外，Alinity m HCV和Aptima HCV Quant Dx Assay也能同时进行核酸定性和定量检测。Mouna等[29]用临床样本在Abbott Alinity m和m2000系统上进行HCV定量检测，结果显示这两种检测结果高度相关。Aptima HCV quant Dx Assay与CAP/CTM v2.0和Abbott Realtime HCV Assay相比，线性范围宽，具有良好的敏感性、特异性和精密度，最低定量检测限为10 IU/ml，符合2018年欧洲肝病学会（EASL）推荐的用于诊断HCV感染的检测下限 < 15 IU/ml[30]。而且，从雅培或者罗氏转换到Aptima进行检测时，无需重新设定患者基线[31]。此外，Aptima HCV quant Dx Assay的干血斑（DBS）检测结果与CAP/CTM v2.0的血清检测结果相近[32]，因此Aptima HCV quant Dx Assay能够为基础设施不足或无法及时提供充足样本的地区提供更加可靠的检测结果。

2.我国用于临床诊断的HCV RNA检测试剂性能评价：《体外诊断试剂注册管理办法修正案》第三条规定[34]，按医疗器械管理的体外诊断试剂用于疾病诊断等，而按照药品管理的用于血源筛查。查询结果显示，我国用于临床诊断的已注册进口HCV RNA检测试剂，包括3家核酸定量检测和1家同时进行定性和定量检测的试剂（表 2）。

我国有17家国产注册且在有效期内的HCV RNA检测试剂，主要以HCV RNA定量检测试剂为主。其中，仅有一家核酸定性检测试剂主要用于丙肝的辅助诊断，具有较好的特异性、重复性、抗干扰能力，灵敏度为50 IU/ml[35]。与罗氏HCV RNA定量检测试剂相比，国产试剂在病毒载量 < 103 IU/ml的样本中灵敏度较低[36]。刘娜等[37]研究也显示国内传统FQ-PCR灵敏度低，最低检测限为500-103 IU/ml，而RT-qPCR的最低检测限低至12-15 IU/ml可满足临床需求。由于不同的提取方法导致提取效率不同，从而使其检测下限不同。根据不同的提取方式，实时荧光定量PCR可分为手工法、柱提取法和磁珠提取法。国内学者[38]将这三种核酸提取方法的HCV RNA定量检测结果与罗氏试剂的检测结果对比，结果显示磁珠法结果较好。随着实时荧光定量PCR（磁珠法）的应用，不仅核酸纯度和提取效率比传统方法有很大提升，而且能实现自动化操作，有些试剂能与国外试剂相媲美[39]。

2019年最新版《丙型肝炎防治指南》指出HCV RNA定量检测适用于确认HCV现症感染、抗病毒治疗前的病毒载量分析、治疗后应答评估，并且推荐使用灵敏度、特异度、精确度高且线性广的方法[7]。湖南圣湘生物科技股份有限公司（圣湘）的HCV RNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）线性范围在25×108~1×108 IU/ml，最低检测限为12 IU/ml。采用磁珠吸附核酸并常温释放，最大程度地避免加热煮沸造成的气溶胶污染，防止出现假阳性结果[40]。但磁珠分离的提取方法，在吹打混匀中可能会造成一部分核酸丢失，而北京纳捷诊断试剂有限公司（纳捷）生产的HCV RNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）采用静态核酸制备技术，无需加热、混匀磁珠，从而避免了核酸丢失。其线性范围在50×108~1×108 IU/ml，最低检测限可达15 IU/ml[41-42]。国内学者[43]推荐采用高敏HCV RNA进行检测，国外指南推荐使用检测下限 < 15 IU/ml的高敏HCV RNA检测试剂[30]，进行急、慢性HCV感染的诊断[44]。

1. WHO推荐检测策略：2018年WHO推荐了最新版成年人和青少年慢性HCV感染的诊断、治疗和监测的检测策略[9]（图 1），包括血清学检测和补充实验。在血清学检测中，推荐使用快速诊断试验或实验室免疫分析法（包括ELISA，化学发光法，电化学发光法）进行抗-HCV检测。如果抗体阳性，则进行补充试验，包括HCV RNA（定性或定量）检测或HCV核心抗原（HCV cAg）检测。若HCV核酸或核心抗原阳性，为HCV现症感染，反之为非HCV现症感染。在资源有限的地区，WHO推荐使用HCV cAg检测作为NAT的替代方法。此检测策略中，WHO把HCV RNA定量检测作为诊断和监测丙肝的金标准，但未设定诊断阈值。因为，研究显示临床中很少低于核酸定量检测的最低检测限[2]，且新一代核酸定量和定性检测试剂具有相同的最低检测限（15 IU/ml）。

2.美国CDC推荐检测策略：2013年美国CDC在Morbidity and Mortality Weekly Report（MMWR）中，推荐了HCV检测策略（图 2）[9]。首先进行抗-HCV快速检测或实验室检测，若结果无反应，表明未检测到抗体可终止检测。对于免疫功能低下的人，可考虑HCV RNA检测。如果在最近6个月内可能接触过HCV者，建议进行HCV RNA检测或后续进行抗-HCV检测。如果抗体检测呈反应性，则直接进行HCV RNA检测。若核酸检出，表明现症感染；反之为非现症感染，适当做补充试验。此外，如果被检测者怀疑最近6个月内可能接触过HCV或有丙肝临床证据，或对检测标本的处理、储存有疑虑，建议重复进行HCV RNA检测。

与WHO推荐检测策略不同，该指南对抗-HCV呈反应性样本直接进行HCV RNA检测，且在补充试验中没有使用核心抗原，而是使用FDA批准的另一种抗-HCV检测方法作为补充试验。因为不同抗-HCV检测方法性能特性不同，当采用不同方法来检测同一个标本时，不太可能每种方法都出现生物假阳性。

3.我国现行的HCV检测策略：《丙型肝炎病毒实验室检测技术规范》指出[8]，目前我国用于临床诊断的HCV检测策略包括抗体检测（筛查试验、补充试验）和核酸检测（核酸定性试验），其中筛查试验为ELISA、化学发光法试验、胶体金法快速试验等，补充试验为免疫印迹试验。抗体检测中，如果筛查结果呈阳性反应，不能直接报告，必须进行复检。再对复检结果呈一阴一阳反应或均为阳性反应的样本进行补充试验，并根据检测结果进行报告，对结果不确定者进行随访（图 3）。核酸定性检测主要针对抗-HCV复检试验阳性的样品，若核酸定性结果为阴性者，需做免疫印迹试验（图 4）。

4.小结：WHO和美国CDC推荐的HCV检测策略中均未将免疫印迹试验作为补充试验，主要由于免疫印迹试验易出现不确定结果，需要进行一系列随访工作。与之相比，2011年颁布的技术规范中仍用免疫印迹试验进行抗体确认[8]。考虑到当时基层医院以血清学检测为主，难以开展对技术和设备要求高的核酸检测。同时，使用ELISA法检测抗-HCV时容易产生假阳性，需要进行抗体确证试验，但不区分现症感染和既往感染。随着技术的提高，第三代EIA抗体检测试剂包被的抗原与重组免疫印迹试验（RIBA）包被的抗原类似，其检测性能有很大改善，如FDA批准的Abbott HCV EIA 2.0和Ortho HCV Version 3.0 ELISA检测试剂，敏感性和特异性可达99%[45]。而且，国产和进口HCV ELISA试剂在敏感性和特异性的差异无统计学意义[46]。国外指南[47]表明，临床在诊断肝病时，若采用上述2种FDA批准的抗体试剂进行检测，可免去确认实验，只在免疫功能低下或者缺陷的患者中，可能出现抗-HCV假阴性。2003年美国CDC在指南[48]中也指出，在低流行区（抗体阳性率 < 10%）假阳性率平均为35%。如果1份标本使用以上两种不同的抗体检测方法，若S/CO ≥ 3.8直接报告阳性结果；反之必须用RIBA确认，但这种方法在2013年美国CDC更新版指南中发生了变化。一方面，由于2011年Chiron公司不再生产RIBA HCV 3.0版。另一方面，不使用RIBA进行抗体确认对诊断HCV感染无显著影响[49]。目前，HCV RNA检测成为美国CDC推荐HCV检测策略中用于确认抗体的检测之一。与RIBA或免疫印迹试验相比，HCV RNA不仅直观地反映病毒的存在，有助于早期诊断以及免疫力低下人群（如移植、HIV感染以及血液透析人群）的诊断，而且能够区分现症感染和既往感染。

WHO将HCV RNA定量检测用于诊断，美国FDA也批准了能同时进行核酸定性和定量检测的试剂。我国HCV检测策略中核酸定性试验因其灵敏度高被用于临床诊断，但一次检测阴性不能完全排除HCV感染，还须加做免疫印迹试验进行确证[8]。而且，新一代HCV RNA定量有与定性检测试剂的相同的最低检测限。如果将HCV RNA定量检测（RT-qPCR法）和抗-HCV检测（ELISA法）联合使用，可以降低漏诊率[50]。资料显示，用于临床诊断的HCV RNA定量检测阈值尚未提出，需进行大量临床试验。为与国际接轨，简化检测流程，缩短周转时间，需结合我国国情组合出适合临床诊断的HCV检测策略。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突