3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 取 1mol/L HCL溶液 48ml , Tris5.98g , 加双蒸馏水至 80ml , 调 pH6.8, 用双蒸馏水稀释至 100ml ,置棕色瓶中, 4℃贮存。

4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液 称取 Tris 6g、 甘氨酸 28.8g , 加蒸馏水 850ml , 调 pH 至 8.3, 加蒸馏水到 1000ml , 4℃贮存。用时可做 10倍稀释。

5、10% 过硫酸铵(AP )(6)四甲基乙二胺(TEMED )或 β-二甲基氨基丙腈(DMAPN )。

6、10%SDS(十二烷基磺酸钠) 称取 SDS 10g,加蒸馏水 100ml 使其溶解。

7、四甲基乙二胺(TEMED )

8、上样缓冲液 取 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 6.25ml ,蔗糖 10g , SDS 2.3g, 1g/L溴酚蓝 10ml ,加 蒸馏水溶解,混合至 100ml。

9、考马斯亮蓝染色试剂 考马斯亮蓝 R250染色液:浓度为 2.5g/L,用甲醇∶醋酸∶蒸馏水 =5∶ 1∶ 5的溶 液配制(V/V)。

10、脱色液:取冰醋酸 7.5ml 、甲醇 5ml ,加蒸馏水至 100ml。

11、蛋白质分子量标志物 市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择 5种以上的已知分子量蛋白质自 行配制,注意其分子量分布要能满足需要,各种蛋白质的浓度基本相等。

(二)仪器

圆盘电泳槽(或垂直板电泳槽)、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床。

SDS-PAGE蛋白质电泳步骤

将收集的各样品加入等体积的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm离心10min，取上清-20℃保存备用。

1）按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。

2）分离胶的制备

按下列成分配制10mL 12%分离胶：

各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中，并为积层胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层水封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的水层，用水清洗凝胶顶部数次，用滤纸吸干凝胶顶端的水。

3）积层胶的制备

按下列成分配制2mL 5%的积层胶：

各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其灌注到分离胶上，灌满后小心插入加样梳，尽可能避免产生气泡。

4）待积层胶凝固后，小心拔下梳子。

5）将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入20μL各样品。

6）样品在积层胶中电泳时，使用80V电压，待溴酚蓝带进入分离胶后，将电压升至120V，继续电泳直至溴酚蓝带到达分离胶的底部且开始泳出胶底面，关闭电源。

7）卸下凝胶，将其浸泡在至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液中，置水平摇床上室温染色至少4h，之后取出染色的凝胶并回收染液，以备再用，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液中，在水平摇床上脱色4-8h，其间更换脱色液3-4次，直至凝胶脱色到条带清晰为止，观察记录结果并拍照。

注意事项

1、做胶：防止漏胶、进气泡以及花胶（水封、插梳子和拔梳子）。

2、加样：两边加loading，加样量一样，加样时间要尽量短，以免样品扩散。

3、电泳：将胶夹好放于电泳槽中，加电泳buffer（内外面不能联通），将电压调到90V开始电泳。

4、本法也适合于其他生物样品中蛋白质的分析。上样量不宜过大,否则会出现过载现象。尤其是考马斯亮 蓝 R250染色, 在蛋白质浓度过高时, 染料与蛋白质的氨基 (-NH) 形成的静电键不稳定, 其结合不符合 Beer 定律,使蛋白质量不准确。

5、Acr 和 Bis 有神经毒性,可经皮肤、呼吸道等吸收,故操作时要注意保护。

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