能让大家优雅的切胶回收是一种怎样的体验

如果不是最近在胶回收问题上碰壁，我恐怕永远不会知道原来切胶回收会遇到这么多问题，小编我可是做了三年分子实验的科研狗啊，分子克隆对于我来说还是很ｅａｓｙ的嘛！然后当我建完库，兴致冲冲的去做胶的时候，跑出来的图片是这个亚子的：

我只想说，妈呀，您还能跑的再诡异一些吗！我当时的想法是这可是我转正第一次重要的实验啊，跑成这种鬼样，我怕是要被骂惨了，这个时候我才意识到原来胶回收这么难的吗，三年的研究生白念了啊！小编我便重新开始查阅资料，认真学习琼脂糖凝胶电泳的方法，经过两周的反复实验，现在小编的水平是不管多大范围的片段随（chui）便(niu)切，当然我不会让老板知道我浪费了多少的琼脂糖啊！放张胶图看看：

本文总结了一些技巧，帮助精确切割目的片段（注：本文所述适合200-600bp的文库片段，切割50bp左右的长度），提高DNA的回收率和纯度。

1. 制备3%琼脂糖凝胶(大胶80mL)：称2.4g琼脂糖置于250ml锥形瓶中，加入80mL 1XTAE，微波炉加热煮沸3次，至琼脂糖全部融化并无气泡，摇匀，一定要保证琼脂糖全部溶解，否则影响条带效果。要想分离500bp以下的小片段，至少要配置2.5%琼脂糖大胶，考虑到分子的共迁移现象，一定要保证胶足够的硬度及时间，让片段分离开。

2. 胶板制备：取电泳槽内的内槽(制胶槽)洗干净，晾干，将内槽置于水平位置，并放置13孔梳子。将冷却到 65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽板上，使胶液缓慢展开，直到整个板表面形成均匀胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。室温下静置15-20min直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加 1XTAE电泳缓冲液至没过胶板为止，缓冲液需要现配先用，防止产物降解 。

3. 加样 :取10μl样品（1ug）与2μl 6×上样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中，13孔梳子每孔最多可加入20ul样品。若DNA含量偏低,则可增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压100V，2.5h以上（时间长短根据产物大小具体判断），将胶槽放到冰上，防止缓冲液的温度过分增加，影响琼脂糖凝胶分离效果。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时 ,停止电泳 。

5. 后染色：将凝胶放在含有SYBR Gold染料的染液中,室温下染色60分钟。

补充： SYBR Gold可以结合双链DNA、单链DNA及RNA，在结合双链DNA后具有２个荧光激发峰，一个位于300nm处，另一个位于495nm处，且对于核酸的检测能力均高于EB及其他SYBR系列的染色剂。而且安全、环保，没有发现至突变性。但是SYBR Gold试剂价格要远高于EB，为了降低使用成本，使用SYBR Gold染色样品的前染色方式会极大的节约试剂的用量，但前染色方式会使得DNA迁 移 速 度 发 生 滞 后。凝胶后染色是电泳完毕后再进行单独染色，因此DNA条带在介质中移动不受染色剂干扰，对于目的基因判断更准确，DNA也不易产生弯曲、变形、拖尾等现象。

6观察和割胶：电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，拍照记录。然后将胶块放在切胶仪上，打开开关，转动旋钮调节光的强度，切割所需范围大小的片段，选用刀口长的手术刀同时用钢尺作为标准。

7. 关于胶回收的一点注意事项

1）让凝胶块充分溶解：很多人切下所需范围的凝胶块之后就开始去溶胶了，其实是不对的，需要把胶块反过来将胶块侧面的凝胶也切除掉；胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收；胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶；。

2）减少在紫外灯下的暴露时间：选用刀口长的手术刀同时用钢尺作为标准，一次下刀就可以将DNA条带分离，减少DNA在紫外灯下的暴露时间，保证回收质量。

3）防止外源DNA的污染：紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片， 其目的在于防止外源DNA的污染。

4）复性DNA:DNA在凝胶缓冲液中加热会变形，所以加热完之后，让其缓慢冷却到室温完成复性。

5）确保乙醇挥发干净：乙醇洗涤完柱子之后必须干燥，才能确保良好的回收率。

6）加热洗脱缓冲液：加热洗脱缓冲液至65℃同时延长室温静置时间，能从膜上洗脱更多的DNA,从而提高产量；需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内， pH值低于7.0会降低洗脱效率；洗脱体积要将柱面覆盖，体积过少影响回收效率；有些试剂盒说为了提高回收率，将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱再回收一遍，小编想说千万别这么做，一遍就可以了。

7)电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好；

8） 回收前的样品量太少，加大点样量；

小编也是一名科研狗，曾经在胶回收上尝试了很多次才得到较为理想的胶回收产物，因此总结了对胶回收过程中的一些问题希望能够帮大家节省一些时间。

大家可能在问小编到底在什么项目呢，当然是“省钱的重测序”即简化基因组测序（Genotyping-by-Sequencing，GBS）, GBS最大的优点是能够将单位个体的测序成本保持在非常低水平,同时进一步简化了建库步骤,有利于大群体的基因分型的需要。大家也看到小编努力做实验的亚子，那就将群体项目交给联川吧！实验交给联川技术部放心，项目放到联川数据售后专业。后续小编还将会继续推出关于GBS项目的知识分享，敬请期待吧！

参考文献：

[1]金磊.核酸染料对DNA条带形态产生的影响分析[J].生物学通报,2015,50(4):51-53.

[2]金磊. 核酸染色剂SYBR—Gold染色特性分析[J]. 中国实验诊断学, 2015(2):194-198.