2）忽略了分离胶的上下方向以及膜的正反面。通常使用预染Marker可解决此问题，此外还可以将胶和膜的一角剪掉来进行区分。

3）转移膜和凝胶不幸干涸了。一般转膜前可将凝胶放在缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉有碍转膜的杂质。也可在这一步通过浸泡对蛋白复性并直接检测蛋白活性。

4）转移缓冲液中甲醇浓度过高，可使蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时也会使凝胶收缩或变硬，抑制高分子量蛋白的转移。此时可降低甲醇浓度或用乙醇或异丙醇代替。

4

转膜后检测结果一团糟

通常为了检测转膜是否成功，可用丽春红进行染色。即将膜放入TBST中清洗一次，而后将其置于丽春红染色工作液中，室温下摇动染色5min并用大量水洗膜，直至水变清无色，蛋白条带清晰。

同样，一些让人头疼的问题也随之而来。丽春红染色后，目的蛋白条带常常黯淡无光，甚至有时不翼而飞。而这些大多是由以下原因造成的：

1）蛋白转膜的时间太短或者处于热度较高的环境之中，此时只需在一个较低的电压下转膜较长的时间即可；

2）在处理“滤纸-凝胶-膜-滤纸”的三明治时，使得膜和胶与对方的背后滤纸相接触导致电流不能通过膜，从而转膜无效。因而，三明治结构中，膜、胶、滤纸的大小最好是一样的。

5

不合适的抗体（一抗&二抗）

对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气。然而要想与WB实验进行愉快的玩耍，就一定要确保抗体的高质量，此时一些可信赖的品牌如Proteintec Group、Epitomics、Abgent、Abnova等便是不错的选择。

另外，还有个最安全可靠的办法就是直接参考文献中使用的抗体，但是仍需要注意3点：一是文章的可靠性，要参考IF高于3分的文章；二是实验必须是同一类实验，别人做IHC的抗体做WB是没有意义的；三是检测的是内源蛋白还是外源蛋白，一般只有内源蛋白的Western blot才有参考意义，但如果同时做了过表达和敲减，也是可以的。

6

抗体因保存不当而降解

抗体无论是保存还是运输都应尽可能的避免反复冻融。收到抗体后，无论是液体还是冻干粉状态，请务必在4℃,12000rpm,离心3分钟，，再打开管盖进行分装和保存（如果抗体体积小于50ul，请延长离心时间至5分钟，以保证全部抗体均离心下来）。

抗体分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发及管壁吸附的影响。复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再次冻起来。抗体工作液应该现配现用，4℃保存尽量不要超过1天。

抗体中的叠氮化钠（终浓度0.02% (w/v)，65Da）尽管会防止微生物污染，但仍会对实验产生影响。又因IgG的分子量是150kDa（IgM约600kDa），可使用截留分子量为14kDa的滤膜将叠氮化钠从抗体中去除。

7

发光实验中背景太高

一般，在很短时间里曝光产生高背景多是由含HRP-抗体浓度过高，洗涤不充分或封闭不充分造成的。另外，如果发光试剂不好，也会制造背景颜色较深，这种情况在较长时间曝光的情况下更为明显。

因而，WB曝光时要注意掌控好时间，时间太长会使得背景深，过短又会不容易曝出条带或曝出条带很浅，所以需要优化出适合自己靶蛋白和实验体系的最佳曝光时间。

撰文 丨萌董董

主编丨尤兰达返回搜狐，查看更多