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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310394055.4(22)申请日 2023.04.13(71)申请人 华南农业大学地址 510642 广东省广州市天河区五山路483号(72)发明人 樊惠英黄圣林孙颖卢曾军李坤(74)专利代理机构 广东广信君达律师事务所 44329专利代理师 余胜茂(51)Int.Cl.C12Q 1/6888(2018.01)C12Q 1/6869(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一组用于单细胞V（D）J测序的猪源TCR序列引物及其应用(57)摘要本发明涉及一组用于。

2、猪源单细胞V(D)J测序的引物及其应用，属于预防兽医技术领域，目前在IMGT(国际免疫遗传学数据库)中，猪源TCR序列信息仍然十分有限，严重制约了猪源TCR多样性的研究。本发明提供一组猪源单细胞V(D)J测序TCR序列引物，以及测序数据的注释方法。可用于获取单个细胞水平的猪源TCR序列信息。权利要求书1页 说明书6页序列表（电子公布）附图1页CN 116640855 A2023.08.25CN 116640855 A1.一组用于单细胞V(D)J测序的猪源TCR序列引物，其特征在于：包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO：110所示的TRA outerR、TRA interR、TRB outer。

3、R、TRB interR、TRD outerR、TRD interR、TRG outerR、TRG interR、OuterF和InterF。2.根据权利要求1所述的猪源TCR序列引物在如下任意一种中的应用：(a)单细胞V(D)J测序；(b)制备或鉴定猪源TCR序列。3.基于单细胞V(D)J测序注释猪源TCR序列的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、细胞悬液制备：使用EDTA抗凝管通过猪前腔静脉采集抗凝血，采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，使用PBS重悬细胞；步骤二、使用细胞计数仪对细胞悬液进行计数，将细胞悬液浓度调整为11.5x103cells/L；步骤三、单细胞微反应体系构建：利用10 。

4、x Genomics ChromiumTM系统，将带有序列标签的Gel Beads、细胞悬液和试剂预混液、油加载到各自的进样通道，通过微流控通道网络形成的“双十字”交叉系统，最终形成由GEMs(Gel Bead in emulsion)包裹的单细胞微反应体系；收集GEMs在PCR仪中进行逆转录实现标签化后构建高通量二代测序文库，并使用测序文库进行高通量二代测序；步骤四、序列质控：原始数据使用cellranger(7.1)软件vdjdenovo参数生成序列文件；步骤五、序列比对与注释：将所述序列文件提交到IMGT/HighVQUEST数据库，以人源TCR数据作为比对，使用R(4.2.1)软件读取。

5、比对结果，剔除基因相似性小于75的序列。4.根据权利要求3所述的方法在如下任意一种中的应用：(a)用于单细胞V(D)J测序猪源TCR序列的批量注释；(b)探究在健康或疾病状态下猪源TCR序列的多样性；(c)获取单个细胞水平的猪源TCR链序列信息；(d)构建猪源TCR序列参考数据库。权利要求书1/1 页2CN 116640855 A2一组用于单细胞V(D)J测序的猪源TCR序列引物及其应用技术领域0001本发明属于预防兽医技术领域，具体涉及一组用于猪源单细胞V(D)J测序的引物及其应用。背景技术0002T细胞是外周血淋巴细胞的重要组成成分，在机体适应性免疫应答中发挥重要作用。T细胞受体(T ce。

6、ll receptor，TCR)是所有T细胞表面的特异性标志，TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，根据肽链的不同可分为 T细胞以及 T细胞；链与链由V基因、J基因以及C基因组成，链与 链则多了一个D基因。0003TCR基因重排，是指T细胞在胸腺分化成熟的过程中，胚系状态的基因由分隔的、无转录活性的基因片段在特异性重组酶的作用下连接成一个完整的、有转录功能的活性基因的过程；重排时，在 与 链中首先进行D基因与J基因的连接，由此产生一个有转录活性的基因，最后再与C基因进行连接，形成一个完整的 或 功能基因；在 与中，则V基因直接与J基因连接后再与C基因相连，形成一个完整的 或功能基因。TCR的基。

7、因重排只发生在T细胞分化的早期，因为特异性重组酶存在严格的时限性，故T细胞在分化成熟的过程中只能进行一次有效的基因重排，保证了一个T细胞克隆只能表达一种特异性TCR。T细胞通过TCR特异性识别和结合主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)递呈的抗原，在外周血中9095的T细胞表达 与 链，少数细胞表达与 链。个体在任何特定时间点其循环系统中所有功能多样性B淋巴细胞和T淋巴细胞的总和称为免疫组库；免疫组库的多样性与机体的健康状况呈正相关，研究年龄，环境，疾病等不同因素影响下免疫组库的多样性，有利于进一步理解机体免疫调控机制。0004传统的T。

8、CR测序是通过RNAseq获取批量的序列信息，但获得的信息是建立在细胞群的基础上，无法从中获取TCR链配对的序列信息，且不能呈现细胞异质性信息，某些数量较少的克隆型信息也会被忽略。10 x genomic公司基于单个细胞水平的V(D)J测序技术可通过微流控技术将单个细胞分配到油包水微体系中，并通过在每一个微反应体系中加入唯一的DNA标记序列(barcode和UMI)区分不同的单细胞，微反应体系逆转录后构建cDNA文库可用于转录组测序、BCR、TCR测序。在TCR序列恒定区设计外部引物和内部引物，通过5 末端快速扩增技术(5 RACE)，在外部引物的基础上再用内部引物进行扩增，可极大的排除第一次。

9、反应的错误扩增，保证PCR扩增的正确性和特异性，通过高通量二代测序后一次可获得数千个单细胞TCR或BCR的信息。单细胞测序技术能够将单个细胞的转录谱与TCR信息联系起来，从而更为精准的研究T细胞在免疫应答中的作用。0005目前，在IMGT(国际免疫遗传学数据库)中，人与小鼠等物种的TCR，BCR序列信息已经相当完善，但是在猪源TCR上，只有TCR 链的信息被记录，关于其它猪源TCR链序列信息的研究仍然较为有限，阻碍了猪源TCR免疫组库的进一步研究。在单个细胞水平，对猪源TCR序列进行注释，发掘占比稀少的TCR序列，揭示猪源TCR链的配对信息，有助于进一步研究机体健康与疾病状态下免疫组库的特征，。

10、进一步认识免疫系统，发掘T细胞在不同机体状况下的说明书1/6 页3CN 116640855 A3变化规律。发明内容0006针对上述问题，本发明的目的在于，提供一组猪源单细胞V(D)J测序TCR序列引物，以及测序数据的注释方法。可用于获取单个细胞水平的猪源TCR序列信息。0007为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：0008第一方面，一组用于单细胞V(D)J测序的猪源TCR序列引物，包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO：110所示的TRA outerR、TRA interR、TRB outerR、TRB interR、TRD outerR、TRD interR、TRG outerR、TRG。

11、 interR、OuterF和InterF。0009第二方面，上述猪源TCR序列引物在如下任意一种中的应用：(a)单细胞V(D)J测序；(b)制备或鉴定猪源TCR序列。0010第三方面，基于单细胞V(D)J测序注释猪源TCR序列的方法，包括以下步骤：步骤一、细胞悬液制备：使用EDTA抗凝管通过猪前腔静脉采集抗凝血，采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，使用PBS重悬细胞；步骤二、使用细胞计数仪对细胞悬液进行计数，将细胞悬液浓度调整为11.5x103cells/L；步骤三、单细胞微反应体系构建：利用10 x Genomics ChromiumTM系统，将带有序列标签的Gel Beads、细胞悬液和试剂。

12、预混液、油加载到各自的进样通道，通过微流控通道网络形成的“双十字”交叉系统，最终形成由GEMs(Gel Bead in emulsion)包裹的单细胞微反应体系；收集GEMs在PCR仪中进行逆转录实现标签化后构建高通量二代测序文库，并使用测序文库进行高通量二代测序；步骤四、序列质控：原始数据使用cellranger(7.1)软件vdjdenovo参数生成序列文件；步骤五、序列比对与注释：将所述序列文件提交到IMGT/HighVQUEST数据库，以人源TCR数据作为比对，使用R(4.2.1)软件读取比对结果，剔除基因相似性小于75的序列。0011第四方面，上述方法在如下任意一种中的应用：(a)用。

13、于单细胞V(D)J测序猪源TCR序列的批量注释；(b)探究在健康或疾病状态下猪源TCR序列的多样性；(c)获取单个细胞水平的猪源TCR链序列信息；(d)构建猪源TCR序列参考数据库。0012有益效果：00131、本发明提供了一组用于扩增猪源TCR序列的5 RACE引物，通过两轮扩增，可极大保证保证PCR扩增的正确性和特异性。00142、本发明所采用的方案中，通过对GEMs(Gel Bead in emulsion)包裹的单细胞微反应体系进行高通量测序二代测序，可获取单个细胞水平的猪源TCR序列信息，TCR链的配对信息。00153、本发明中所提供的方法注释的基于单个细胞的TCR链序列，可用于构建。

14、参考猪源TCR序列库，用于后续免疫组库研究。说明书2/6 页4CN 116640855 A4附图说明0016图1是猪源TCR测序注释流程图。具体实施方式0017目前，在IMGT(国际免疫遗传学数据库)中，猪源TCR序列信息仍然十分有限，严重制约了猪源TCR多样性的研究。本发明的目的在于，提供一组猪源单细胞V(D)J测序TCR序列引物，以及测序数据的注释方法。可用于获取单个细胞水平的猪源TCR序列信息。00181本发明提供的用于猪源TCR单细胞V(D)J测序外部与内部的引物如下。00192作为本发明的优选方案，提供的引物组可用于制备或鉴定猪源TCR序列。00203作为本发明的优选方案，所提供的下。

15、游引物可通过5 RACE技术扩增猪源TCR序列。00214作为本发明的优选方案，测序时通过两轮扩增提高了序列的准确性，首轮扩增使用下游外部引物(outerR)，第二轮扩增使用下游内部引物(interR)，上游引物使用10 xgenomic公司提供的上游通用引物(OuterF，InterF)。00225作为本发明的优选方案，测序样品为猪外周血单核细胞(PBMC)或分选后的T淋巴细胞。00236本发明提供的基于单细胞V(D)J测序注释猪源TCR序列的方法包括以下步骤：(1)细胞悬液制备：使用EDTA抗凝管通过猪前腔静脉采集抗凝血，采用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，使用PBS重悬细胞；(2)使用细胞计。

16、数仪对细胞悬液进行计数，将细胞悬液浓度调整为11.5x103cells/L；(3)调整浓度后的细胞悬液委托上海晶能生物技术有限公司分选为带有序列标签的GEMs(Gel Bead in emulsion)包裹的单细胞微反应体系，收集GEMs在PCR仪中进行逆转录实现标签化后构建高通量二代测序文库，并使用测序文库进行高通量二代测序；(4)序列质控：原始数据使用cellranger(7.1)软件vdjdenovo参数生成序列文说明书3/6 页5CN 116640855 A5件；(5)序列注释：将上述序列文件提交到IMGT/HighVQUEST数据库，以人源TCR数据作为比对，使用R(4.2.1)软件。

17、读取比对结果，剔除基因相似性小于75的序列。00247根据本发明的方法，可探究在健康或疾病状态下猪源TCR序列的多样性。00258根据本发明的方法，可获取单个细胞水平的猪源TCR链序列信息。00269根据本发明的方法，获得的序列可用于构建猪源TCR序列参考数据库，用于后续免疫组库研究。0027下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。0028实施例100291、外周血单核细胞的分离：将采集的10mL抗凝血转入50mL离心管中，加入10mL PBS溶液稀释，轻轻混匀；取15mL离心管，先加入5mL淋巴细胞分离液。然后将5mL稀释的血液轻轻加到离心管的淋巴细胞分离液上层；20。

18、00rpm，20min；离心后从上至下分别为血浆层、淋巴细胞层、淋巴细胞分离液层以及红细胞和粒细胞层。吸取淋巴细胞层至另一15mL离心管中加入PBS至1015mL，1500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基重复上述步骤清洗细胞；使用细胞计数仪进行计数，使用PBS作为稀释液将浓度调整为11.5x103 cells/L。00302、单细胞微反应体系构建：利用10 x Genomics ChromiumTM系统，将带有序列标签的Gel Beads、细胞悬液和试剂预混液、油加载到各自的进样通道，通过微流控通道网络形成的“双十字”交叉系统，最终形成GEMs(Gel Bead in emuls。

19、ion)包裹的单细胞微反应体系。收集GEMs在PCR仪中进行逆转录，并通过分子标签标记所有单细胞。00313、单细胞TCR免疫组库测序：将逆转录后的GEMs委托上海晶能生物技术有限公司构建测序高通量二代测序文库，并进行高通量二代测序。00324、原始数据组装：使用cellranger(7.1)软件vdjdenovo参数生成序列文件。00335、数据质控与注释：使用R(4.2.1)软件读取序列文件，使用R包tidyverse筛选包含TCR内部引物的序列，将筛选后的序列提交到IMGT/HighVQUEST数据库，以人源TCR数据作为比对，基因相似度小于75的基因将会被剔除，根据比对结果对基因片段进。

20、行命名。0034筛选的序列如SEQ ID NO：1135所示。比对结果如下表14所示。0035表1：部分TCR 链V基因、J基因与人源TCR 链V基因、J基因相似度。说明书4/6 页6CN 116640855 A60036表2：部分TCR 链V基因、J基因与猪源TCR 链V基因、J基因相似度。0037表3：TCR 链V基因、J基因与人源 链V基因、J基因相似度。0038表4：TCR序列V基因、J基因与人源 链V基因、J基因相似度。0039本发明所提供的引物可用于单细胞V(D)J测序或5 端RACE扩增用于获取猪源TCR序列。0040本发明所提供的序列注释方法，可用于单细胞V(D)J测序猪源TCR序列的批量注释，所获得的序列通过分子标签可进一步获得TCR链配对信息。0041需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护说明书5/6 页7CN 116640855 A7范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。说明书6/6 页8CN 116640855 A8图1说明书附图1/1 页9CN 116640855 A9。