SDS

2023-11-01 22:40| 来源: 网络整理| 查看: 265

SDS-PAGE – 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)By索拉夫生物•27年2023月XNUMX日

什么是 SDS-PAGE？十大代表延誤與等待的塔...

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十大代表延誤與等待的塔羅牌SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种强大且常用的按分子量分选蛋白质的技术。 Ulrich K. Laemmli 创建了它，它已成为法医学、遗传学、生物技术和分子生物学中不可或缺的工具。SDS-PAGE的思想是消除蛋白质结构和电荷的影响，只关注蛋白质分子尺寸。该工艺采用两种基本成分：十二烷基硫酸钠 (SDS) 和聚丙烯酰胺凝胶。SDS 是一种阴离子去污剂，通过附着蛋白质并破坏其天然结构而使其变性。经过 SDS 处理后，蛋白质均匀地涂覆有与其分子量成比例的负电荷。这种涂层中和了蛋白质的固有电荷，使它们能够在电泳过程中简单地按大小进行分类。 Ezoic

另一方面，聚丙烯酰胺凝胶充当蛋白质在受到电场作用时移动的介质。丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体的聚合产生凝胶基质。可以改变这些单体的浓度以产生具有不同孔隙率的凝胶，从而允许在特定分子量范围内分离蛋白质。SDS-PAGE 过程由多个阶段组成。首先，用 SDS 和还原剂（例如 β-巯基乙醇或二硫苏糖醇 (DTT)）处理蛋白质样品，还原剂会破坏二硫键并使蛋白质进一步变性。然后将蛋白质混合物放入聚丙烯酰胺凝胶孔中。当电流引入凝胶基质时，带负电荷的 SDS 包被的蛋白质向正极移动。较小的蛋白质比较大的蛋白质在凝胶上迁移得更快并且移动得更远，因为迁移速率与分子量的对数成反比。 Ezoic

电泳后，可以通过用考马斯亮蓝或银染等染料对凝胶进行染色来观察分离的蛋白质。可以测量和分析产生的蛋白质条带，以确定样品中不同蛋白质的分子量和相对丰度。SDS-PAGE 在研究和其他学科中有许多应用。它经常用于评估蛋白质样品、纯化特定蛋白质、确定蛋白质纯度以及研究蛋白质-蛋白质相互作用。科学家可以通过根据分子量分离蛋白质来获得对复杂蛋白质混合物的组成和特性的重要见解。总而言之，SDS-PAGE 是一项强大的技术，它改变了蛋白质分析领域。这种方法将十二烷基硫酸钠与聚丙烯酰胺凝胶相结合，可以简单地根据蛋白质的大小进行分离，为研究人员提供了研究蛋白质结构、功能和关系的宝贵工具。 Ezoic

SDS-PAGE的定义

SDS-PAGE 是一种使用凝胶基质和变性剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 根据蛋白质分子量分离蛋白质的技术。

SDS PAGE概述

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是研究蛋白质混合物的常用方法。通过根据蛋白质的大小对蛋白质进行分类，可以确定蛋白质纯度并估计蛋白质分子量。

要开始 SDS-PAGE 过程，请使混合物中的蛋白质变性以去除任何二级或四级结构。阴离子去污剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 用于实现这种变性。 SDS 附着在蛋白质的多肽主链上，使它们展开并带负电。由于 SDS 结合的量与多肽链的长度成正比，因此蛋白质带有显着的负电荷。

SDS-PAGE 的首选介质是聚丙烯酰胺凝胶。这种人造凝胶是透明的、化学惰性的且热稳定的。它可以制成不同的孔径，以适应不同尺寸的蛋白质。该凝胶由丙烯酰胺单体组成，丙烯酰胺单体结合形成聚合物基质。使用电泳将蛋白质推过凝胶，这称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)。

SDS-PAGE 凝胶由两层组成：堆积或间隔凝胶以及分离或分离凝胶。

堆积凝胶由浓度约为 5% 的聚丙烯酰胺制成的大孔组成。它在分离凝胶的顶部产生，并由 pH 值约为 6.8 的 Tris 缓冲液制成，该值高于电泳缓冲液的 pH 值。浓缩胶的目的是在蛋白质进入分离胶之前将其浓缩到一个紧密的区域中。

另一方面，分离凝胶具有较小的孔，由浓度范围为 5% 至 30% 的聚丙烯酰胺制成。它由 pH 值为 8.8 的 Tris 缓冲液制成。蛋白质在凝胶中根据其分子大小进行分离。较小的蛋白质可以更容易地穿过凝胶基质，因此比较大的蛋白质迁移得更快。

当施加电流时，带负电的蛋白质会在凝胶中迁移，较小的蛋白质比较大的蛋白质移动得更远。电泳后，可以通过用考马斯亮蓝等染料或其他检测方法对凝胶进行染色来观察蛋白质。

总而言之，SDS-PAGE 是一种用于分析蛋白质混合物的强大技术，它使用 SDS 变性并使用聚丙烯酰胺凝胶进行分离。基于尺寸分离，可以确定蛋白质纯度并估计分子量。不同孔径的堆积和分离凝胶分别用于促进蛋白质浓缩和分离。

什么是 SDS 页？SDS-PAGE 的性质

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）具有许多不同的特性，使其成为一种出色的蛋白质分离方法：

聚丙烯酰胺基凝胶：聚丙烯酰胺凝胶用作 SDS-PAGE 的介质。通常，这种凝胶被制造为夹在两块玻璃板之间的板状凝胶。聚丙烯酰胺凝胶为基于质量的蛋白质分离提供了坚固且惰性的基质。SDS（十二烷基硫酸钠）：SDS 是 SDS-PAGE 的重要组成部分。它起到表面活性剂的作用，并以每克蛋白质约 1.4 克 SDS 的速率与蛋白质结合。 SDS 隐藏了蛋白质的固有电荷并提供一致的荷质比，从而可以根据质量进行精确分离。由于 SDS 的存在，蛋白质主要带负电荷，这覆盖了其固有的电荷特性。 Ezoic

胶束形成：在水溶液中，SDS 在高于称为临界胶束浓度 (CMC) 的特定浓度时形成球形胶束。 SDS 的 CMC 范围为 7 至 10 毫摩尔。由于其外表面为阴离子，胶束不吸附蛋白质，并且由大约 62 个 SDS 分子组成。 SDS 单体利用疏水相互作用与蛋白质相互作用。蛋白质变性： SDS 会导致蛋白质变性。蛋白质在浓度大于 0.1 毫摩尔时展开，而大多数蛋白质在浓度大于 1 mM 时变性。由于二级、三级和四级结构会被这种变性过程破坏，因此可以根据蛋白质的一级结构来分离蛋白质。蛋白质迁移：在电场的影响下，蛋白质穿过聚丙烯酰胺凝胶向阳极迁移。根据其质量，每种蛋白质以特定的速率迁移。较小的蛋白质在凝胶中移动得更快、更远，而较大的蛋白质则移动得更慢并且更靠近起始位点。 Ezoic

四级结构测定： SDS-PAGE 通常用于确定单个蛋白质亚基或单体的质量，因为它破坏了蛋白质的四级结构。另一方面，某些 SDS 抗性蛋白复合物可以耐受 SDS 的变性作用，从而可以进行研究。由于需要大的活化能，经常需要热处理来使此类化合物变性。替代表面活性剂：虽然 SDS 是 SDS-PAGE 中使用最广泛的表面活性剂，但 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）或 16-BAC（16-苄基二甲基十六烷基氯化铵）等其他表面活性剂也可用于 CTAB-PAGE 或 BAC-PAGE 等特殊应用。

总而言之，SDS-PAGE 使用聚丙烯酰胺凝胶、SDS 表面活性剂以及 SDS 的变性作用，根据蛋白质的质量来分离蛋白质。该技术已发展成为蛋白质分析的关键工具，并广泛应用于各种科学领域。

目的

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）的目标可概括如下：

SDS-PAGE制备：了解和学习如何制备凝胶是 SDS-PAGE 的主要目标之一。这包括正确制备堆积和分离凝胶、正确制备聚丙烯酰胺凝胶以及正确制备具有适当 pH 和离子强度的电泳缓冲液。蛋白质纯度测定： SDS-PAGE 是测定蛋白质纯度的常用方法。蛋白质样品的 SDS-PAGE 分析可以表明蛋白质制剂中是否存在杂质或污染物。纯蛋白质将在凝胶上显示为单个条带，而污染物或其他蛋白质将显示为多个条带。 Ezoic

分子量测定：确定纯蛋白质的分子量是 SDS-PAGE 的另一个重要目标。通过将蛋白质的迁移与已知的分子量标记进行比较来评估蛋白质的大致大小是可行的。凝胶中的蛋白质迁移与分子量成反比，这意味着较小的蛋白质比较大的蛋白质移动得更快、更远。质量控制： SDS-PAGE 是蛋白质纯化操作中重要的质量控制步骤。它有助于确定蛋白质纯化程序是否成功并确保不存在污染或降解。通过检查感兴趣蛋白质的纯度和分子量，研究人员可以相信其实验结果的完整性和可靠性。对比分析： SDS-PAGE 可以比较不同实验环境下的蛋白质样品。研究人员可以通过同时在凝胶上运行不同的样品来检查蛋白质表达、翻译后修饰和蛋白质-蛋白质相互作用的变化。这种比较方法有助于更好地理解蛋白质在响应各种环境时所经历的功能和结构变化。 Ezoic

总之，SDS-PAGE 的目标是制备凝胶、测定蛋白质纯度并估计蛋白质分子量。 SDS-PAGE 还可用作质量控制工具，并允许对蛋白质样品进行比较研究。通过实现这些目标，研究人员将获得对蛋白质特性和质量的重要见解，这将有利于分子生物学、生物化学和生物技术等领域。

SDS-PAGE的原理

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）的原理是基于带电分子在电场中的迁移以及基于蛋白质长度的蛋白质分离。

带电分子迁移：根据原理，带电分子置于电场中时会向带有相反电荷的电极迁移。这种迁移是由于带电分子和电极之间的吸引力或排斥力而发生的。就蛋白质而言，迁移取决于带电物质的相对迁移率。 Ezoic

尺寸的影响：较小的分子在电泳过程中经历的阻力较小，因此在凝胶基质中迁移得更快。在 SDS-PAGE 中，该原理适用于根据蛋白质大小进行分离。与较大的蛋白质相比，较小的蛋白质在凝胶中迁移得更快。结构和电荷的影响：蛋白质的结构和电荷也在其迁移速率中发挥作用。然而，在SDS-PAGE中，十二烷基硫酸钠(SDS)和聚丙烯酰胺凝胶的使用很大程度上消除了蛋白质结构和电荷的影响。 SDS 是一种以恒定摩尔比与蛋白质骨架结合的去污剂。它使蛋白质变性并赋予多肽链负电荷，负电荷与其长度成正比。聚丙烯酰胺凝胶基质：聚丙烯酰胺凝胶用作网状基质，用于根据蛋白质的长度分离蛋白质。聚合丙烯酰胺形成稳定的凝胶，可以承受电泳过程。凝胶的强度使得实验过程中易于处理和操作。聚丙烯酰胺凝胶电泳为分离典型大小的蛋白质提供了有效的介质。 Ezoic

通过结合 SDS 的变性作用和聚丙烯酰胺凝胶的使用，SDS-PAGE 能够仅根据蛋白质的多肽链长度来分离蛋白质。这一原理使研究人员能够分析蛋白质样品，确定其分子量并评估其纯度。 SDS-PAGE 是分子生物学、生物化学和生物技术等各个科学学科中广泛使用的技术，用于蛋白质的定性和定量分析。

什么是 SDS 在 SDS-PAGE 中的作用?

SDS（十二烷基硫酸钠）在 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中的作用对于蛋白质的变性和均匀电荷分布至关重要。 SDS 是一种洗涤剂，在此过程中发挥多种作用：

蛋白质变性： SDS对蛋白质有很强的变性作用。它通过破坏非共价键，特别是有助于蛋白质三级结构的二硫键来破坏蛋白质的天然构象。这个变性过程将蛋白质展开成线性链。与蛋白质结合： SDS 以每克蛋白质约 1.4 克 SDS 的比例与蛋白质主链结合。它与蛋白质的疏水区域相互作用，从而覆盖多肽链。这种结合确保蛋白质完全变性并均匀地涂有 SDS 分子。赋予负电荷： SDS 是一种阴离子洗涤剂，这意味着它带有负电荷。当它与蛋白质结合时，它会给多肽链带来与其长度成比例的负电荷。带负电荷的 SDS 分子有效地掩盖了蛋白质的固有电荷，使蛋白质在凝胶中的迁移完全取决于其大小。SDS-蛋白质复合物的形成： SDS 与蛋白质的结合导致 SDS-蛋白质复合物的形成。这些复合物具有均匀的荷质比，允许在电泳过程中根据分子量来分离不同大小的蛋白质。SDS 胶束的形成：在高于一定浓度（称为临界胶束浓度 (CMC)）的水溶液中，SDS 分子形成球形胶束。这些胶束有助于溶解蛋白质的疏水区域并确保它们在凝胶中均匀分散。

通过结合 SDS 的变性和电荷赋予特性，SDS-PAGE 消除了蛋白质结构和电荷的影响，从而能够仅根据蛋白质的多肽链长度来分离蛋白质。这项技术已成为蛋白质分析的基石，使研究人员能够评估蛋白质纯度并准确确定分子量。

SDS-PAGE的原理SDS-PAGE 的要求及其作用

在 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中，使用多种材料来有效地执行该过程。这些材料及其在 SDS-PAGE 中的作用如下：

电源：电源用于将交流电 (AC) 转换为直流电 (DC)。它们提供驱动电泳过程所需的电能。凝胶： SDS-PAGE 中使用的凝胶基质可以在实验室制备或作为预制凝胶购买。聚丙烯酰胺是凝胶基质的主要成分，它形成网状结构，可以根据蛋白质的分子量分离蛋白质。电泳室：电泳室设计用于在电泳过程中牢固地固定 SDS-PAGE 凝胶。这些室为蛋白质的分离提供了稳定的环境。蛋白质样品：待分析的蛋白质样品通过用 SDS-PAGE 样品缓冲液稀释来制备。样品缓冲液含有十二烷基硫酸钠 (SDS)，它会使蛋白质变性并赋予它们负电荷。此外，还添加还原剂（例如二硫苏糖醇或 2-巯基乙醇）来破坏二硫键并防止蛋白质三级折叠。运行缓冲区：加载到凝胶上的蛋白质样品在 SDS-PAGE 运行缓冲液中运行。电泳缓冲液为电泳过程中的蛋白质分离提供适当的 pH 值和离子强度。染色和脱色缓冲液：电泳完成后，通常用染料（例如考马斯染色液）对凝胶进行染色，以使蛋白质条带可视化。然后使用脱色溶液对染色的凝胶进行脱色，以去除多余的染料并增强蛋白质条带的对比度。蛋白质梯：蛋白质梯，也称为分子量标记，是具有已知分子量的蛋白质的混合物。它被加载到凝胶的单独泳道上，并用作确定目标蛋白质分子量的参考。三：三用作 SDS-PAGE 中的缓冲液，因为它能将稳定的 pH 值保持在所需范围内（通常为 pH 7.0 至 9.0）。它有助于为蛋白质分离提供适当的环境。丙烯酰胺：丙烯酰胺是制备聚丙烯酰胺凝胶的关键成分。它经过聚合形成交联网络，从而形成凝胶基质。双丙烯酰胺（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）：双丙烯酰胺是一种用于丙烯酰胺凝胶聚合的交联剂。它在丙烯酰胺分子之间形成共价键，有助于凝胶的稳定性和结构。十二烷基硫酸钠 (SDS)： SDS 是一种阴离子去污剂，可通过与蛋白质结合并破坏其天然结构来使其变性。它还根据蛋白质的多肽链长度按比例赋予蛋白质负电荷，从而允许在电泳过程中进行基于大小的分离。过硫酸铵 (APS)：APS 是一种化学催化剂，用于引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合，从而形成凝胶基质。N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)： TEMED 通常与过硫酸铵一起用作丙烯酰胺凝胶聚合的催化剂。它有助于引发反应并促进凝胶形成。

这些材料在 SDS-PAGE 中共同发挥着重要作用，能够根据蛋白质的分子量对蛋白质进行变性、分离和可视化。

SDS PAGE 的化学要求丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 30% (29:1)2.5X Tris-SDS 缓冲液 (pH 8.8) 65 毫升 125 毫升 2-8o5X Tris-SDS 缓冲液 (酸碱度 6.8)预染蛋白梯5X Tris-甘氨酸-SDS 凝胶电泳缓冲液 5X 上样缓冲液蛋白质样品 1蛋白质样品 2染色液脱色液过硫酸铵 (APS)四甲基乙二胺 (TEMED)琼脂糖

其他所需材料；

玻璃器皿：锥形瓶、量筒、烧杯试剂：蒸馏水其它要求：蛋白质电泳仪、微量移液器、吸头、微波/燃烧器/热板 SDS 或十二烷基硫酸钠

SDS 使蛋白质变性 | 图片来源：https://himedialabs.com/TD/HTP001.pdfSDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去垢剂，常用于 SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）等生物和生化方法。它在 SDS-PAGE 中的作用对于蛋白质变性和分离（取决于分子量）至关重要。当给予蛋白质样品时，SDS 通过疏水相互作用与蛋白质牢固结合。 SDS 与蛋白质的结合会扰乱其原始结构并导致它们展开成线性链。 SDS 以每克蛋白质约 1.4 克 SDS 的稳定比例与蛋白质结合。由于 SDS 的负电荷支配着蛋白质的任何固有电荷，因此这种相互作用确保蛋白质获得与其质量成正比的均匀负电荷。在 SDS-PAGE 过程中，SDS-蛋白质复合物在电场的影响下穿过聚丙烯酰胺凝胶。凝胶起到分子过滤器的作用，允许根据蛋白质的大小或分子量来分离蛋白质。较小的蛋白质可以更容易、更快速地穿过凝胶，而较大的蛋白质会遇到更大的阻力，迁移速度更慢。结果，蛋白质根据其重量被分成分子单元。将已知分子量的标准蛋白质与参考标记在同一凝胶上进行电泳，以确定未知蛋白质的分子量。测量这些标记物的相对迁移率 (Rf)，它代表蛋白质带移动的距离相对于跟踪染料（如溴酚蓝）移动的距离。通过在半对数图上绘制已知蛋白质标记物的 Rf 值与其各自的分子量，创建非典型曲线。根据 Rf 值，该曲线可用于推断未知蛋白质的分子量。总之，SDS 在 SDS-PAGE 中至关重要，因为它使蛋白质变性，赋予一致的负电荷，并允许在凝胶中进行基于大小的蛋白质分离。它是这种广泛使用的蛋白质分子量测定方法的关键组成部分。

通过将相对于每个 Rf 值的分子量放在半对数图上，利用大小已知的蛋白质标记的 Rf 值生成非典型曲线。然后根据 Rf 值推断出未知蛋白质的分子量。SDS PAGE 是如何工作的？SDS-PAGE（或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种按分子量对蛋白质进行分类的流行方法。该过程包括许多重要的阶段和机制，使蛋白质能够在凝胶基质中分离。SDS-PAGE技术从凝胶的制备开始，凝胶分为两部分：浓缩胶和电泳胶。浓缩胶中的孔比流动胶中的孔大。当凝胶放入电泳室时，电压会通过凝胶传递。当施加电压时，将含有蛋白质组合的样品缓冲液注入凝胶一端的孔中。样品缓冲液中存在 SDS，它会使蛋白质变性并赋予它们负电荷。它还含有甘氨酸，它在浓缩胶中带正电，但在迁移到流动凝胶中时带负电。当施加电压时，样品缓冲液和浓缩胶中的氯离子快速向正极迁移，形成离子前沿。甘氨酸和氯离子的迁移率差异导致凝胶内产生较大的电压梯度，导致蛋白质-SDS 复合物向负极移动。浓缩胶中的大孔阻力很小，使得蛋白质-SDS 复合物能够堆积并集中在浓缩胶和电泳胶的交界处附近。这种堆积作用形成了一条密集的蛋白质-SDS 复合物带。当甘氨酸离子移动到流动凝胶中时，凝胶的 pH 值发生变化，使其更接近甘氨酸氨基的 pKa。结果，相当一部分甘氨酸分子带负电。这些带负电的甘氨酸分子开始以与氯离子相同的速度迁移，从而缩小了先前调节蛋白质在凝胶上流动性的电压间隙。运行凝胶具有较窄的孔径，可抵抗蛋白质的流动。由于凝胶的筛分能力，蛋白质会根据其大小以不同的速率迁移。较小的蛋白质-SDS 复合物可以更容易、更快速地穿过凝胶基质，而较大的复合物会遇到更大的阻力，迁移速度更慢。运行凝胶中的蛋白质迁移与其在凝胶孔隙率指定范围内的分子量的对数成正比。结果，不同大小的蛋白质分离成沿着凝胶长度延伸的不同条带，形成分子量梯。通过比较各种分子量的已知蛋白质标准品的迁移位置与未知蛋白质的迁移位置，可以计算出未知蛋白质的分子量。总之，SDS-PAGE 使用电场根据蛋白质的分子量来分离蛋白质。在堆积和运行凝胶中使用 SDS 和不同的孔径可以浓缩和分离蛋白质-SDS 复合物，从而产生可用于计算分子量的离散条带。

SDS PAGE 是如何工作的？ | 资料来源：https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/technical-documents/protocol/protein-biology/gel-electrophoresis/sds-pageSDS-PAGE实验方案 SDS 页协议

SDS 页流程图 | 图片来源：https://himedialabs.com/TD/HTP001.pdf确保玻璃面板固定在设备上，同时垫片位于两个边缘。制备 1% 琼脂糖（0.05g 在 5ml 蒸馏水中）。煮沸直至琼脂糖溶解，然后在板底部倒一层均匀的水平琼脂糖以固定板。让它凝固冷却 5-10 分钟。

12%分离胶的制备

制备分离凝胶包括以下成分：烘焙材料金额30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液6毫升蒸馏水3毫升2.5X Tris-SDS 缓冲液 (pH 6.8)6毫升10% APS 溶液125微升泰美18微升

将凝胶放在板之间，静置约一小时。凝胶冷却后，立即将其倒在盘子上。

倒入，加入蒸馏水，直到它是水平的凝胶。大约一小时后，通过翻转铸件去除所有液体。

5%浓缩胶的制备

要制备浓缩胶，请按以下顺序混合成分：

烘焙材料金额30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液1.3毫升蒸馏水5.1毫升5X Tris-SDS 缓冲液 (pH 6.8)1.6毫升10% APS 溶液75微升泰美10微升

添加 TEMED 后，通过旋转烧杯彻底混合所有成分。将浓缩胶放在分离胶的顶部。然后，立即放置梳子，确保避免气泡。应该让它静置约 30 分钟。

重要提示：丙烯酰胺是一种潜在的神经毒素，必须格外小心处理。始终戴上口罩并戴上手套。

将 1X Tris-甘氨酸-SDS 凝胶电泳缓冲液以连接两个电极的方式放入装置中，从而完成流动。小心地从浓缩凝胶中取出梳子。样品制备：取 2 管用于蛋白质样品。相应地标记它们。您应该从试管中取出 20 毫升的每个样品，并添加 5 毫升的 5X 样品加载缓冲液。含有 100oC 蛋白质样品的试管在沸水浴中。不要煮沸带有 PrestainedProtein Ladder 的试管。取 5ml 预染蛋白梯和 20ml 样品，在对堆叠凝胶内的梳孔进行热处理后立即取下。电源线应根据标准协议连接到电泳电源：红色阳极和黑色阴极。电泳过程为 100 V、10 mA，直到染料前沿比凝胶密封的前沿高 0.5 cm。将凝胶放入装有蒸馏水的塑料托盘中，将凝胶从板之间取出。凝胶应清洗 1 分钟。然后，用水冲洗凝胶并进行脱色程序。凝胶的染色和脱色从电泳装置中取出凝胶后，除去凝胶表面多余的水。将凝胶放入托盘或容器中，加入 50ml 染色液以完全覆盖凝胶。让凝胶浸泡在染色溶液中，直到蛋白质条带变得明显。有时，可能需要将凝胶在染色溶液中孵育过夜，以确保最佳的条带可视化。一旦达到所需的染色强度，小心地从染色溶液中取出凝胶。只要染色液保持有效，最多可以重复使用三次。用蒸馏水冲洗染色的凝胶，去除多余的污渍。在装有蒸馏水的托盘中轻轻摇动凝胶，然后用新鲜的蒸馏水替换水。重复此漂洗过程三到四次，每次换水，以确保彻底去除污渍。准备 50ml 脱色液并将其添加到装有凝胶的托盘中。脱色溶液通常是有助于从凝胶中去除背景染色的溶剂。以恒定速率摇动装有凝胶的托盘以促进脱色过程。继续脱色，直到凝胶上的蛋白质条带变得清晰可见，同时背景染色被去除。这可能需要一些时间，并且可能需要定期评估凝胶的外观。一旦达到所需的脱色效果，小心地从脱色溶液中取出凝胶。与染色液类似，脱色液也可以重复使用最多 XNUMX 次，前提是它仍能有效去除背景染色。

完成染色和脱色步骤后，可以目视检查凝胶以观察蛋白质条带。或者，可以进一步处理凝胶以进行记录，例如通过扫描或拍照，以保存和分析结果。

SDS-PAGE观察及结果

SDS-PAGE观察及结果泳道 1：预染蛋白梯泳道 3：蛋白质样品 1泳道 5：蛋白质样品 2 解释

染色、脱色、凝胶后，您可以将样品的分子量与蛋白质标记物的重量进行比较。蛋白质样品 1 是血清样品，因此观察到多个条带。蛋白质样品 2 是一种纯化的蛋白质，因此可以看到 1 个主要条带。

SDS-PAGE 样品制备取 1ml 大肠杆菌菌株 DH5α 培养液于 1.5 ml eppendorf 管中。然后以 12000 rpm 离心 5 分钟。然后丢弃上清液。然后在试管中加入 500 μl TE，轻轻摇动溶解试管。然后加入相同体积的样品缓冲液。最后将样品在沸水浴中加热 5 分钟，然后立即继续冰。

如果需要，要分析的样品可选择与化学变性剂混合，通常为 SDS核酸用蛋白质或尿素。 SDS 是一种阴离子洗涤剂，可使二次和非-变性二硫键连接的三级结构，另外对每个蛋白质施加负电荷与其质量成正比。尿素破坏核酸碱基对之间的氢键，导致组成链分离。将样品加热到至少 60 °C 会进一步促进变性。

SDS-PAGE实验方案

SDS-PAGE 方法由凝胶制备、样品制备、电泳、蛋白质染色或蛋白质印迹以及生成的条带图案分析组成。

1. 凝胶制备

凝胶制备是凝胶电泳中根据大小分离蛋白质的关键步骤。以下是凝胶制备所涉及的步骤：

收集材料：收集所有必要的材料，包括梳子、玻璃板、垫片（硅胶管）和活页夹。确保玻璃板已彻底清洁乙醇使用前。组装凝胶铸造模具：使用清洁的玻璃板组装凝胶铸造模具。该模具由两块玻璃板组成，用活页夹固定在一起，在它们之间留有空间以倒入凝胶。制备丙烯酰胺溶液：混合凝胶制备所需的所有试剂，TEMED（四甲基乙二胺）除外。该溶液通常包含丙烯酰胺、双丙烯酰胺、缓冲液和水。添加 TEMED：当凝胶准备好倒入时，将 TEMED 添加到丙烯酰胺溶液中。 TEMED 充当聚合催化剂。倒入分离凝胶：将丙烯酰胺溶液倒入玻璃板之间的空间，形成分离凝胶。为了防止与空气（氧气）接触，从而抑制聚合，请用水覆盖溶液。让丙烯酰胺聚合 20-30 分钟以形成凝胶。去除气泡：在凝胶聚合之前，将丁醇添加到凝胶的顶部。添加丁醇有助于去除凝胶中可能存在的任何不需要的气泡。插入梳子：将梳子插入玻璃板之间的空间。梳子用于在凝胶中创建孔或泳道，将蛋白质样品加载到其中。根据要使用的样品数量和分子量标记物，选择具有所需泳道数量的适当梳子。凝胶聚合：让丙烯酰胺完全聚合，形成固体凝胶。一旦聚合，凝胶就成为固定在玻璃板之间的“凝胶盒”。

SDS-PAGE实验方案

凝胶制备

凝胶制备根据实验的具体要求进行定制。丙烯酰胺的浓度决定了凝胶的网目大小，影响蛋白质的分离。较高的丙烯酰胺浓度 (6-15%) 适用于分离小蛋白质，而具有不同丙烯酰胺浓度的梯度凝胶可用于特殊应用。

此外，可以在分离胶之前使用浓缩胶，以在蛋白质进入分离过程之前浓缩蛋白质。浓缩凝胶利用甘氨酸离子、氯离子和蛋白质的不同迁移速率来创建浓缩的蛋白质区域。

正确的凝胶制备可确保在凝胶电泳过程中根据蛋白质的大小分离蛋白质的最佳条件。

凝胶生产

凝胶制备好后，可用于凝胶电泳实验，根据蛋白质的分子量或其他性质来分离和分析蛋白质。

2. 样品制备

样品制备是蛋白质分析和凝胶电泳的关键步骤。以下是样品制备所涉及的步骤：

开水：首先在烧杯中煮沸水。该水将用于样品制备过程中的各个步骤。样品缓冲液的制备r：将 2-巯基乙醇添加到样品缓冲液中。 2-巯基乙醇有助于使蛋白质变性并减少可能存在的任何二硫键。样品和标记物制备：将缓冲溶液放入微量离心管中，并向其中添加蛋白质样品。同样，准备含有分子量标记的单独管。这些标记有助于在凝胶电泳过程中确定蛋白质的分子量。蛋白质变性：将样品（包括蛋白质样品和标记物）煮沸较短的时间，通常少于 5 分钟。此步骤确保蛋白质完全变性。添加样品缓冲液：煮沸后，向每个样品管中添加适当体积的样品缓冲液。样品缓冲液有助于稳定蛋白质并为它们提供电泳所需的电荷。混合和热处理：轻轻弹动试管以混合试管中的内容物，以确保样品和缓冲液正确混合。使用加热块将管在 100°C 下加热 3 分钟。此步骤进一步使蛋白质变性，并有助于分解任何二级或三级结构。离心：热处理后，将管在 15,000°C 下高速（约 1 rpm）离心 4 分钟。此步骤有助于分离任何沉淀或不溶性物质，上清液用于 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）。加载缓冲液添加：对于蛋白质样品（细胞或组织裂解液），添加等体积的上样缓冲液。上样缓冲液包含示踪染料和稳定剂等附加成分，有助于电泳过程中的样品上样和可视化。额外的煮沸和离心：将蛋白质样品和上样缓冲液的混合物在 95°C 下煮沸 5 分钟。随后，将混合物高速（约 16,000 xg）离心 5 分钟。这些步骤确保凝胶电泳前样品的完全变性和正确混合。储存或电泳：制备好的样品如果不立即用于凝胶电泳，可保存在-20°C。或者，将样品加载到凝胶上进行凝胶电泳。

正确的样品制备对于获得准确可靠的凝胶电泳结果至关重要。它涉及变性、二硫键还原以及样品与缓冲液和上样染料的适当混合，以确保蛋白质的最佳分离和分析。

3. 电泳

电泳的步骤包括将变性的样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，施加电压以诱导蛋白质迁移，并观察分离的条带。以下是详细步骤：

凝胶制备：通过将其浇铸在凝胶盒或凝胶装置中来制备聚丙烯酰胺凝胶。应将凝胶浸入含有合适电解质的电泳缓冲液中。样品加载：使用移液器，小心地将变性蛋白质样品装入凝胶孔中。每个样品都放置在其指定的孔中。电源连接：将装有样品的凝胶盒放入电泳仪的电极组件中。确保其牢固地固定在夹具支架上。将电泳装置连接至电源。电泳缓冲液添加：将 1x 电泳缓冲液倒入铸造框架的开口中，使其填充凝胶的孔。缓冲液充当电泳过程中蛋白质迁移的介质。施加电压：凝胶准备好并添加缓冲液后，用盖子盖住水箱以形成封闭系统。打开电源并施加合适的电压，通常每厘米凝胶长度约 100 V 或 10-20 V。电压导致带负电的分子（包括蛋白质）通过凝胶向带正电的阳极迁移。电泳持续时间：让电泳过程运行所需的持续时间，通常为半小时到几个小时，具体取决于施加的电压和凝胶长度等因素。当不同大小的蛋白质根据其分子量以不同的速率迁移通过凝胶时，就会发生分离。条带可视化：电泳后，将凝胶从装置中取出并观察条带。一种常见的方法是使用紫外光观察蛋白质条带。紫外照明可以使可能被荧光染料染色或标记的条带可视化。

SDS-PAGE实验方案

这些步骤提供了电泳过程的总体概述，允许根据分子大小分离蛋白质。值得注意的是，根据电泳技术或所进行的分析的类型，可能存在特定的方案和变化。

4. 凝胶染色

凝胶染色是蛋白质分析中的关键步骤，可实现凝胶内分离蛋白质的可视化和检测。以下是凝胶染色过程的概述：

固定术：电泳分离完成后，通常会固定凝胶以固定蛋白质并准备染色。常见的固定液由 50% 乙醇和 10% 冰醋酸组成。将凝胶浸入该溶液中约 1 小时。染色液配制：在固定凝胶的同时，制备染色溶液。考马斯染色是一种广泛使用且简单的方法，染色溶液由 50% 甲醇、10% 冰醋酸和 0.1% 考马斯亮蓝染料组成。染色液应充分混合。染色：固定期结束后，将凝胶转移至新鲜的染色溶液中，确保凝胶完全浸没。染色步骤使染料与蛋白质结合，导致其可视化为蓝色条带。凝胶的染色时间通常为 1 至 12 小时，但具体染色时间可能会根据所需的染色强度和所分析蛋白质的灵敏度而变化。脱色：一旦达到所需的染色水平，即可对凝胶进行脱色，以去除多余的染料并增强染色的蛋白质条带与凝胶背景之间的对比度。脱色液由40%甲醇和10%冰醋酸组成。将凝胶浸入脱色液中，多次更换溶液，以利于高效脱色。脱色过程持续进行，直到背景清晰，并且蛋白质条带清晰可见。

不同的染色方法和染料在染色和脱色过程中可能会有差异。一些染色技术，例如银染、氨基黑染色和固绿 FCF 染色，可能需要不同的染色溶液和脱色方案。此外，荧光染色和蛋白质印迹等免疫检测方法为蛋白质可视化和分析提供了替代方法。

凝胶染色是蛋白质分析中的关键步骤，因为它使研究人员能够观察和分析凝胶中分离的蛋白质，从而提供有关蛋白质大小、丰度和潜在修饰的宝贵见解。

5。分析

凝胶电泳后的蛋白质样品分析涉及对通过蛋白质染色获得的条带图案的检查和解释。以下是分析过程中的一些重要考虑因素：

条带图案：凝胶中的蛋白质染色会形成不同的条带，代表不同蛋白质的分子量。条带图案提供了样品中存在的蛋白质及其相对丰度的直观表示。糖蛋白：糖蛋白具有不同的糖基化水平，可以在凝胶上表现出更宽且模糊的条带。这是由于糖基化位点上 SDS 的吸附不均匀，影响了迁移并导致条带不太清晰。膜蛋白：膜蛋白以其疏水性和结合脂质的倾向为特征，在水溶液中可能具有较低的溶解度。这可能导致 SDS-PAGE 中沉淀和不完全迁移，从而导致跨膜蛋白条带上方出现“拖尾”效应。调整 SDS 浓度和蛋白质上样量有助于缓解此问题。超载：在凝胶中加入高浓度的特定可溶性蛋白质可能会产生半圆形条带，该条带可能会遮盖相邻条带或与相邻条带重叠。这使得区分具有相似分子量的蛋白质变得困难。对比度和纯度：泳道内条带之间的对比可以提供对蛋白质样品纯度的深入了解。低对比度可能表明存在多种蛋白质（低纯度），或者在纯化蛋白质的情况下，表明存在蛋白水解降解。可以观察到降解为完整蛋白质条带下方的降解条带，最终导致降解条带下方出现均匀的“涂片”。文档：通常通过对凝胶拍照或扫描来记录条带图案。这样可以永久记录蛋白质分离并有利于进一步分析和比较。记录对于随后恢复或识别特定蛋白质条带非常重要。凝胶提取：在某些情况下，可能需要回收各个条带中存在的蛋白质以进行进一步分析或下游应用。凝胶提取技术可用于从特定凝胶区域分离和收集蛋白质，从而实现后续表征或鉴定。

对凝胶电泳获得的蛋白质条带模式的分析提供了有关蛋白质样品的有价值的信息，包括其分子量、相对丰度和潜在的修饰。通过仔细检查和解释这些模式，研究人员可以深入了解所研究蛋白质的组成和行为。

分子量测定

大小标记（黑色 X）的蛋白质在 log M 与 Rf 的表示中显示出近似直线。

分子量测定是凝胶电泳后蛋白质分析的一个重要方面。该过程涉及以下步骤：

相对迁移距离的测量：为了准确测定蛋白质的分子量，需要测量分离凝胶内各个蛋白质条带的相对迁移距离。这些测量通常一式三份进行，以提高精度。相对迁移率（Rf值）的计算：相对迁移率，也称为 Rf 值或 Rm 值，通过将蛋白质带移动的距离除以缓冲液前沿移动的距离来计算。两个距离都是从分离凝胶的起点开始测量的。缓冲液前沿距离大约对应于样品缓冲液中存在的染料（例如溴酚蓝）的迁移距离。半对数图的构建：蛋白质与尺寸标记的相对距离相对于其已知分子量以半对数绘制。该图允许观察分子量的对数和相对迁移率之间的线性关系。分子量的测定：通过将未知蛋白质的相对迁移率与绘图的线性部分进行比较或进行回归分析，可以估计蛋白质的分子量。该估计基于其相对流动性值。

影响分子量测定的因素：

糖基化蛋白质：具有糖基化的蛋白质条带可能会显得模糊，使得其分子量的测定不太精确。碱性或酸性蛋白质：含有大量碱性氨基酸（例如组蛋白）的蛋白质可能由于其正电荷而表现出较慢的迁移。这可能导致高估它们的分子量，甚至阻止它们迁移到凝胶中。相反，富含酸性氨基酸的蛋白质可能迁移得更快，导致低估其分子质量。

分子量测定是表征蛋白质和评估其大小的重要工具。通过准确测量相对迁移距离并利用大小标记，研究人员可以估计未知蛋白质的分子量，深入了解其结构特性并促进进一步分析和比较。

不同的凝胶染色方法1. 考马斯蓝染色 – 要求和程序

考马斯蓝染色是一种广泛使用的可视化通过 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质的方法。它提供高灵敏度并允许长期储存凝胶。考马斯蓝染色的步骤如下：

所需试剂：

凝胶固定溶液（500 mL）：甲醇：250毫升冰醋酸：50 mL水：200 毫升考马斯溶液：考马斯亮蓝 R-250 (CBB R-250)：0.1%甲醇：40%冰醋酸：10%使用 Whatman 1 号滤纸过滤染色溶液。脱色解决方案：甲醇：50毫升冰醋酸：35 mL凝胶存储解决方案：冰醋酸：25 mL水：475 毫升

程序：

完成 SDS-PAGE 电泳后，小心地从凝胶装置中取出凝胶，并将其放入塑料托盘中。将凝胶固定溶液添加到托盘中，确保凝胶完全浸没。将托盘放在摇床上或轻轻搅拌溶液以固定蛋白质。让凝胶固定大约 2 小时。从托盘中取出凝胶固定溶液并将其丢弃。将考马斯溶液添加到托盘中，完全覆盖凝胶。将托盘放在摇床上或轻轻搅拌溶液以确保染色均匀。让凝胶染色 2-4 小时。染色时间可以根据所需的染色强度而变化。染色步骤后，小心倒掉考马斯溶液，并用蒸馏水清洗凝胶数次。轻轻冲洗凝胶以去除多余的污渍，然后继续冲洗直至背景变得清晰。将甲醇和冰醋酸混合制备脱色溶液。将脱色溶液添加到托盘中，完全覆盖凝胶。将托盘放在摇床上或轻轻摇动溶液以使凝胶脱色。脱色约 4 小时或直至在清晰的背景下看到清晰的蓝色条带。脱色的持续时间可以根据染色强度和凝胶厚度而变化。脱色完成后，小心倒出脱色溶液并丢弃。现在可以根据需要储存凝胶或拍照。

为了储存凝胶，将冰醋酸和水混合制备凝胶储存溶液。将凝胶转移到凝胶存储溶液中，确保其完全浸没。凝胶可以储存在该溶液中，以便长期储存和后续分析。

考马斯蓝染色提供了凝胶上蛋白质条带的可见表示，允许对蛋白质分离进行分析和记录。

2. 银染——要求和程序

银染色是一种高度灵敏的蛋白质检测方法，通常用于可视化通过 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质。它具有出色的灵敏度，适合检测低丰度蛋白质。银染的流程如下：

所需试剂：

固定解决方案：乙醇：50毫升乙酸：10mL水：40 毫升30%乙醇溶液

程序：

完成 SDS-PAGE 电泳后，小心地从凝胶装置中取出凝胶，并将其放入合适的容器中。将乙醇、乙酸和水混合制备固定液。将凝胶浸入固定液中并固定 40 分钟。为了获得更清晰的背景，可以在定影剂中浸泡过夜。除去固定液，用 30% 乙醇溶液清洗凝胶 10 分钟。确保清洗过程中凝胶完全浸没。乙醇洗涤后，用超纯水冲洗凝胶 10 分钟以除去任何残留的乙醇。倒出水并制备敏化剂溶液。将凝胶浸入敏化剂溶液中并孵育 10 分钟。敏化剂溶液可增强银染过程中蛋白质检测的灵敏度。除去敏化剂溶液，用水洗涤凝胶两次，每次洗涤持续 10 分钟。此步骤有助于去除多余的敏化剂溶液。倒出水并将凝胶浸入银溶液中 10 分钟。银溶液可以将蛋白质检测为银染条带。倒出银溶液并用水洗涤凝胶 1.5 分钟以除去未反应的银离子。根据制造商的说明准备开发人员解决方案。将凝胶浸入显色剂溶液中并孵育 3 至 7 分钟。显色剂溶液触发与目标蛋白质相对应的银染条带的形成。要停止开发过程，请将 5 mL 的停止溶液添加到开发溶液中并孵育 5 分钟。终止溶液终止反应并固定已形成的条带。除去显色剂/终止液并用超纯水清洗凝胶 15 分钟以除去任何残留的化学物质。银染凝胶可以拍照或保存在新鲜的超纯水中。将凝胶储存在水中有助于保存银染条带。

对于双重染色，可以按照制造商的说明首先用考马斯亮蓝 R-250 (CBB R-250) 对凝胶进行染色，然后使用上述程序进行银染。这使得蛋白质可视化具有高灵敏度并且与下游分析技术兼容。

荧光染色剂如 SYPRO 和 Lucy 染色剂也可用于蛋白质电泳。这些染色剂具有荧光检测的优点，可以通过在黑暗中将凝胶浸入荧光染色剂中或在电泳过程中将染色剂与阴极缓冲液混合来应用。

3. 可逆凝胶染色 – 要求和程序

可逆凝胶染色是一种有用的技术，可用于检测聚丙烯酰胺凝胶（PAGE 凝胶）上的蛋白质以及随后的蛋白质印迹。它具有可逆性的优点，这意味着染色后，凝胶可以脱色并进一步加工用于下游应用。 R-PROB 是可逆凝胶染色剂的一个例子，它专门检测蛋白质。以下是可逆凝胶染色的程序：

所需试剂：

用于膜和聚丙烯酰胺凝胶的可逆蛋白检测试剂盒 (RPROB)定影液 (F7264)10％乙酸乙二胺四乙酸 50 毫米

程序：

完成 SDS-PAGE 电泳后，小心地从凝胶装置中取出凝胶，并将其放入合适的容器中。根据制造商的说明准备固定溶液。将凝胶浸入固定液中并孵育 20 分钟。重复此步骤两次，以确保蛋白质正确固定在凝胶上。用水冲洗固定凝胶两次，每次持续30分钟。此步骤有助于去除凝胶中残留的固定液。按照 R-PROB 染色剂随附的说明制备染色溶液。将凝胶在染色溶液中孵育 20 至 40 分钟，同时轻轻搅拌。 R-PROB 染色剂将与蛋白质结合，使其可视化。染色步骤后，用 10% 乙酸冲洗凝胶，小心洗掉多余的染色剂。这有助于从凝胶中去除任何非特异性结合的染色剂。为了脱色，准备浓度为 50 mM 的 EDTA 溶液。用 EDTA 溶液清洗凝胶以去除污渍。此步骤通过将染色剂与蛋白质分离来帮助逆转染色过程。EDTA脱色后，用水或固定液清洗凝胶15次，每次XNUMX分钟。这些额外的洗涤有助于去除任何残留污渍，并确保凝胶准备好进行进一步处理。

可逆凝胶染色后，可以进一步处理凝胶以进行蛋白质印迹。脱色的凝胶可以转移到膜上，并且可以使用适当的抗体和检测方法来检测感兴趣的蛋白质。

4. 铜染色 – 要求和程序

铜染色是一种用于可视化凝胶上蛋白质迁移和分离的技术。它涉及使用氯化铜 (CuCl2) 溶液作为可逆染色剂。铜染色的流程如下：

所需试剂：

0.3 M CuCl2 溶液0.25 M Tris 和 0.25 M EDTA 溶液

程序：

完成 SDS-PAGE 电泳后，从凝胶装置中取出凝胶，并用蒸馏水短暂冲洗。冲洗时间不应超过30分钟。准备 0.3 M CuCl2 溶液。将凝胶浸入 CuCl2 溶液中并孵育 10 分钟。 CuCl2 溶液将与凝胶上的蛋白质结合，使其可视化。染色步骤后，用去离子水冲洗凝胶以去除多余的染色。此步骤有助于为蛋白质可视化创建清晰的背景。蛋白质将在蓝色背景下显示为清晰区域。染色强度可能因蛋白质浓度和其他因素而异。如果您需要对凝胶进行完全脱色以用于后续的蛋白质印迹或其他应用，请在 pH 为 0.25 的 0.25 M Tris 和 9 M EDTA 溶液中清洗染色的凝胶。重复此清洗步骤多次，直到凝胶脱色到所需的值等级。脱色后，可以将凝胶转移到转移缓冲液中进行进一步处理，例如将蛋白质转移到膜上进行蛋白质印迹。

值得注意的是，铜染色是一种可逆染色，这意味着可以通过适当的洗涤步骤将染色剂从凝胶中去除。这使得下游应用不受染色试剂的干扰。

电泳缓冲液

电泳缓冲液电泳法SDS-PAGE（InvitrogenTM)BN-PAGE（InvitrogenTM)NSDS-PAGE样品缓冲液106 mM Tris HCl141 mM Tris 碱基0.51毫米EDTA0.22 mM SERVA 蓝色G-2500.175 mM 酚红2% LDS10％甘油pH值8.550 mM BisTris50 毫米氯化钠16mMHCl10％甘油0.001% 丽春红 SpH值7.2100 mM Tris HCl150 mM Tris 碱基0.01875% 考马斯G-2500.00625% 酚红10％甘油pH值8.5运行缓冲液50 毫米拖把50 mM Tris 碱基1毫米EDTA0.1% 安全数据表pH值7.7阴极50 mM BisTris50 mM 三甘氨酸0.02% 考马斯G-250pH值6.8阳极50 mM BisTris50 mM 三甘氨酸pH值6.850 毫米拖把50 mM Tris 碱基0.0375% 安全数据表pH值7.7

SDS-PAGE的应用

SDS-PAGE，即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，在各个领域有着广泛的应用。以下是 SDS-PAGE 的一些关键应用：

分子量测定： SDS-PAGE 通常用于测量蛋白质和其他分子的分子量。通过将蛋白质样品的迁移与已知分子量标记进行比较，可以估计蛋白质的大小。蛋白质大小估计： SDS-PAGE 可以根据蛋白质在凝胶内的迁移距离来估计蛋白质的大小。这些信息对于研究蛋白质结构和功能很有用。肽图谱： SDS-PAGE 可用于肽图分析，其中涉及蛋白质样品中肽的识别和表征。该技术有助于研究蛋白质结构、翻译后修饰和序列分析。对比分析： SDS-PAGE 能够比较不同蛋白质结构或样品的多肽组成。它可以揭示蛋白质表达的差异、识别异构体并评估蛋白质纯度。蛋白质纯度评估： SDS-PAGE通常用于评估蛋白质样品的纯度。通过观察其他条带或污染物的存在，可以确定蛋白质制剂的纯度。蛋白质印迹： SDS-PAGE 是蛋白质印迹的一个组成部分，蛋白质印迹是一种广泛使用的技术，用于检测和识别复杂混合物中的特定蛋白质。 SDS-PAGE 根据大小分离蛋白质，随后转移到膜上，以便使用特定抗体检测目标蛋白质。蛋白质泛素化研究： SDS-PAGE 用于研究蛋白质泛素化，这是一种调节蛋白质降解和信号转导的翻译后修饰。通过分离和可视化泛素化蛋白质，研究人员可以研究它们在细胞过程中的作用。艾滋病检测：在医学诊断中，SDS-PAGE 用于 HIV 检测。它通过分子量来分离 HIV 蛋白，随后使用患者特异性抗体进行蛋白质印迹分析，有助于确定血清中是否存在 HIV 特异性蛋白。蛋白尿评估： SDS-PAGE 用于评估蛋白尿，这是一种以尿液中蛋白质水平异常为特征的疾病。通过使用 SDS-PAGE 分析尿液样本中各种血清蛋白（如白蛋白、Alpha-2-巨球蛋白和 IgG）的水平，可以评估蛋白尿。

总体而言，SDS-PAGE 是一种多功能技术，在蛋白质分析、蛋白质表征和诊断应用中发挥着至关重要的作用。它的易用性、成本效益以及与其他分析方法的兼容性使其成为各种研究和诊断实验室的宝贵工具。

SDS PAGE 重要说明

进行 SDS-PAGE 时，遵循某些说明以确保结果准确可靠非常重要。以下是一些需要记住的重要说明：

阅读程序：开始实验之前，请仔细阅读整个过程，了解所涉及的步骤和任何具体要求。提前准备试剂：在开始实验之前，准备所需的试剂，例如 10% APS 溶液和 1X Tris-甘氨酸 SDS 凝胶电泳缓冲液。按照提供的说明准确地准备这些解决方案。将它们储存在建议的温度下并在规定的时间内使用。解冻样品：如果您有冷藏样品，请确保在使用前将其完全解冻。这将确保样品处于适合分析的状态。清洁设备：在开始实验之前，清洁您将使用的整个机器或设备。使用适当的清洁剂和蒸馏水彻底清洁设备。确保板或凝胶没有任何可能影响结果的污垢或污染物。混合试剂：使用前，将配制好的溶液充分混合。例如，将 1X Tris-Glycine SDS 凝胶电泳缓冲液充分混合，然后再将其添加到凝胶装置中。适当的混合可确保试剂均匀分布并可供使用。运行缓冲液的重复使用：如果指定，1X Tris-甘氨酸 SDS 凝胶电泳缓冲液可以重复使用多次，通常最多 4-5 次。跟踪使用次数以避免超出建议的限制。重新使用缓冲液之前，检查是否有任何污染或降解的迹象。

通过遵循这些重要说明，您可以确保 SDS-PAGE 实验的准确性、可靠性和重现性。

SDS PAGE的优点

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）在蛋白质分析和表征方面具有多种优势。以下是 SDS-PAGE 的一些主要优势：

分子量测定：SDS-PAGE 可以准确测定样品中蛋白质的分子量。通过将凝胶上蛋白质条带的迁移与已知分子量的标准蛋白质标记进行比较，研究人员可以估计所研究蛋白质的大小。蛋白质检测： SDS-PAGE 能够根据特定蛋白质的独特特征和质量检测其。通过观察凝胶上的蛋白质条带，研究人员可以识别样品中是否存在特定蛋白质。这在蛋白质分析和诊断应用中特别有用。物种鉴定： SDS-PAGE 使基于蛋白质质量的物种区分成为可能。通过比较不同物种的蛋白质谱，研究人员可以根据其不同的蛋白质模式来识别和区分它们。这在进化生物学、法医学和环境监测等领域尤其有价值。高分辨率： SDS-PAGE 是一种高分辨率凝胶电泳系统。它根据蛋白质分子的质量提供出色的分离和分辨率。这样可以对复杂混合物中的蛋白质进行精确分析和表征，从而更好地了解蛋白质组成和相互作用。适用性广： SDS-PAGE 广泛应用于各个科学学科。它用于生物化学、分子生物学、蛋白质组学、临床诊断和药物研究。其多功能性和有效性使其成为蛋白质分析和表征的宝贵工具。可比性和标准化： SDS-PAGE 提供了蛋白质分离和分析的标准化方法。使用已知分子量的蛋白质标记可以实现不同实验和实验室之间的可比性。这确保了不同研究的结果一致且可靠。性价比高：与其他蛋白质分析技术相比，SDS-PAGE 是一种相对经济有效的方法，例如质谱法。它的仪器和试剂成本较低，可供广泛的研究人员和机构使用。

总之，SDS-PAGE在蛋白质分析方面具有众多优势，包括准确的分子量测定、特异性蛋白质检测、物种鉴定、高分辨率、广泛的适用性、可比性和成本效益。其简单性和有效性使其成为蛋白质科学领域的基本技术。

SDS PAGE 的局限性

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）具有一定的局限性，应予以考虑。以下是与 SDS-PAGE 相关的一些限制：

有关结构的有限信息： SDS-PAGE 主要提供有关蛋白质的分子量和大小的信息。虽然它可以帮助识别不同的蛋白质条带，但它不能提供有关蛋白质三维结构或功能特性的详细信息。更深入的结构分析需要其他技术，例如 X 射线晶体学或核磁共振 (NMR)。核酸检测： SDS-PAGE 不适用于核酸（例如 DNA 或 RNA）的可视化或分析。由于 SDS-PAGE 旨在根据蛋白质分子的质量变性和分离蛋白质分子，因此核酸在凝胶上将不可见。核酸分析使用琼脂糖凝胶电泳或聚合酶链反应 (PCR) 等特定技术。有限纯度评估：虽然 SDS-PAGE 可以指示多个蛋白质条带的存在及其相对强度，但它不能提供有关蛋白质样品纯度的直接信息。量化方法如紫外-可见光谱或其他生化测定需要准确确定蛋白质样品的纯度。基于尺寸的分辨率： SDS-PAGE 分离主要基于蛋白质的分子量。它可能无法有效分离分子量相似但结构或构象特征不同的蛋白质。可能需要其他技术，例如二维凝胶电泳或液相色谱，以实现更高分辨率和更好地分离复杂的蛋白质混合物。样品制备工件： SDS-PAGE 需要适当的样品制备，包括二硫键的变性和还原，以确保结果准确。样品处理不当或不完全变性可能会导致凝胶上出现伪影或扭曲的蛋白质条带，从而影响结果的解释。固有的可变性：SDS-PAGE 与任何实验技术一样，具有固有的可变性和与重现性相关的局限性。凝胶制备、运行条件和染色方案等因素可能会导致实验之间存在差异，从而影响结果的一致性。有限的动态范围： SDS-PAGE 对于蛋白质分离的动态范围有限。它可能不适合分析分子量非常高或非常低的蛋白质，因为它们可能难以可视化或可能迁移到凝胶基质之外。

尽管存在这些限制，SDS-PAGE 由于其简单性、成本效益以及提供有关蛋白质大小和分离信息的能力，仍然是蛋白质分析中有价值且广泛使用的技术。它通常与其他技术结合使用，以克服这些限制并获得对蛋白质更全面的了解。

解决方案的问题

当使用各种实验室技术的解决方案时，可能会出现某些问题，从而影响结果的质量和可靠性。以下是解决方案可能出现的一些常见问题及其潜在解决方案：

低电流和长运行时间：如果由于电流低而导致运行时间异常长，请将电压增加 25-50%。这将有助于维持适当的电流并加快电泳过程。凝胶分辨率差：如果凝胶的分辨率较差，可能是由于孔中样品过多而导致的。避免过度填充孔，因为它可能导致伪影并影响分离。对于特定的凝胶尺寸，请遵循推荐的凝胶上样量。如果使用较小的凝胶，请相应调整样品加载量。堆积凝胶长度：倾倒浓缩胶时，确保其从孔底到分离胶顶部的长度约为1 cm。这将允许正确堆叠蛋白质样品并提高分辨率。快速运行时间：如果电泳运行太快，可能是由于施加的电流太高。将电压降低 25-50%，以降低运行速度并实现更好的分离。纯化蛋白质样品的条带过载：如果纯化的蛋白质样品出现多个条带，则可能表明样品制备存在问题。确保样品制备正确且无污染。样品准备好后立即进行电泳，以尽量减少任何潜在的降解或额外的条带。堆积凝胶的聚合：在移除梳子之前，让堆积凝胶聚合至少 30 分钟。这可确保凝胶正确固化，从而使样品在上样过程中沉入孔底。无气泡凝胶：倒入凝胶时，确保没有气泡存在。气泡可能会导致凝胶某些部分的条带保留在原位，并且在电泳过程中不会向下移动。在凝胶凝固之前注意消除任何气泡。正确拧紧螺丝：避免将夹具组件上的螺钉拧得过紧。过度拧紧可能会使凝胶变形并影响分离。使用适当的紧固程度来固定凝胶而不导致变形。凝胶混合物的均匀性：在倒入凝胶之前，确保凝胶混合物充分混合。彻底混合各组分以获得均匀的溶液，因为不均匀的混合物会导致凝胶形成不一致并影响结果的质量。

通过使用解决方案解决这些常见问题，您可以提高各种实验室技术中实验结果的可靠性和准确性。

常见问题什么是 SDS-PAGE？

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种用于根据分子量分离蛋白质的技术。它涉及用 SDS 使蛋白质变性，并通过聚丙烯酰胺凝胶基质进行电泳。

SDS-PAGE 中为何使用 SDS？

SDS 是一种阴离子去污剂，可以使蛋白质变性，用相对于其质量的负电荷包裹蛋白质，并将其展开成线性结构。这使得蛋白质可以在电泳过程中根据大小进行分离。

SDS-PAGE 中浓缩胶的用途是什么？

浓缩胶充当筛分基质，帮助蛋白质样品在进入分离胶之前将其浓缩成薄而聚焦的条带。它提高了电泳过程中蛋白质的分辨率和分离。

SDS-PAGE 如何分离蛋白质？

在 SDS-PAGE 过程中，会对凝胶施加电场，使蛋白质根据其大小在凝胶基质中迁移。较小的蛋白质移动得更快并且迁移得更远，而较大的蛋白质迁移得更慢并且更靠近样品加载孔。

SDS-PAGE 中分子量标记的用途是什么？

分子量标记，也称为蛋白质梯，是具有已知分子量的蛋白质的混合物。它与样品一起加载到凝胶上，并作为估计样品中未知蛋白质大小的参考。

如何在 SDS-PAGE 中实现蛋白质可视化？

电泳后，通常通过用考马斯亮蓝或银染剂等染料对凝胶进行染色来可视化蛋白质。这些染料与蛋白质结合，并可将其检测为凝胶上的条带或斑点。

SDS-PAGE可用于测定蛋白质浓度吗？

虽然 SDS-PAGE 提供有关蛋白质大小和分离的信息，但它并不是量化蛋白质浓度的可靠方法。分光光度法，例如 Bradford 测定或 BCA 测定，通常用于蛋白质定量。

SDS-PAGE 可以识别翻译后修饰吗？

单独的 SDS-PAGE 无法识别特定的翻译后修饰 (PTM)。通常采用蛋白质印迹或质谱等其他技术来检测和表征 PTM。

SDS-PAGE 有哪些局限性？

SDS-PAGE 的一些局限性包括其无法提供详细的结构信息、难以可视化核酸、纯度评估有限、结果的可变性以及非常大或小的蛋白质的动态范围有限。

SDS-PAGE有哪些应用？

SDS-PAGE广泛应用于研究和工业的各个领域。它用于蛋白质分析、纯化、表征和蛋白质-蛋白质相互作用研究。它也是分子生物学、生物化学、生物技术和临床诊断中的重要技术。

参考资料诺瓦科夫斯基 AB、沃比格 WJ、彼得林 DH。天然 SDS-PAGE：蛋白质的高分辨率电泳分离，保留天然特性，包括结合的金属离子。金属学。 2014年6月；5(1068):78-10.1039。 doi：4/c00033mt24686569a。电话号码：4517606； PMCID：PMCXNUMX。https://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/sds-page.htmlhttps://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/sds-page-10x-sds-running-bufferhttps://www.bio-rad.com/en-in/applications-technologies/sds-page-analysis?ID=LW7FGX4VYhttp://microbiology.ucdavis.edu/heyer/wordpress/wp-content/uploads/2013/11/dna_page.pdfhttps://www.cbrnetechindex.com/Biological-Detection/Technology-BD/Electrophoresis-BD-T/Polyacrylamide-Gel-Electrophoresis-BD-Ehttps://www.rockland.com/resources/sds-page-protocol/https://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/method/SDSPAGE/SDSPAGE.htmlhttps://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gellab2.htmlhttps://www.sigmaaldrich.com/IN/en/technical-documents/protocol/protein-biology/gel-electrophoresis/sds-pagehttps://thesciencenotes.com/sds-page/

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