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双判定标准判定qPCR扩增特异性,提升Ct值真实性 让实验小白也可以做出好的qPCR结果
qPCR实验易做,但数据分析并非想象中的那么容易!数据分析的好与坏,极大程度上依赖于qPCR原始结果的质量。 qPCR结果的评价指标 •溶解曲线,是qPCR结果判定的第一要素。它的作用是判定目的基因是否得到扩增。理论上,当反应体系中仅是目标基因的扩增,才是有效扩增。 •标准曲线,是qPCR结果判定的金标准。(在溶解曲线判定为特异性扩增后)它的作用是测定引物的扩增效率及试剂的检测上下限。根据文章发表对于qPCR数据的要求,扩增效率应在90-110%。 •扩增曲线,是直接生成qPCR定量的数据,即Ct值。从试剂对比角度而言,Ct值大小常被用于判定试剂扩增效率的高低。 产品描述 Hieff Unicon® Power qPCR SYBR Green Master Mix,这是一款旨在解决诸多qPCR实验常见疑难问题的qPCR试剂: •它减少了大量引物验证的预实验工作,是一款具备强引物兼容性的Mix, •它明确了qPCR溶解曲线峰型的标准——“单峰的形状”,对于“什么溶解曲线是好的溶解曲线”的解读具有参考意义, •它让时间不再碎片化,1次体系配制,24 h时间自由支配 产品特点 □引物兼容性强:针对遵循qPCR引物设计原则设计的引物,使用Hieff Unicon® Power 引物使用率可达97%; □模板加入量灵活:可检测10-107个拷贝个数的基因片段; □特异性高:标准溶解曲线峰型,有效避免“胖”峰、“多”峰的出现; □稳定性强:产品经50次反复冻融验证,扩增性能无变化; □操作灵活:配制好的qPCR反应液4℃保存24 h,扩增性能无变化; □扩增时间短:每个扩增循环中,退火、延伸一步完成,用时15 sec。 产品性能展示 1. 超高特异性,简化了qPCR实验的引物设计
图1. Hieff® Unicon Power预混液实现了引物的高特异性扩增 以293T细胞cDNA为模板,利用Prime5软件设计200bp扩增长度的片段(GC含量:30%-70%)的引物共1000对,随机挑选88对,使用Hieff Unicon®Power预混液测定引物的扩增特异性。通过溶解曲线分析,88个检测片段中有86个(97.7%)目标片段有效扩增,说明Hieff Unicon® Power预混液引物兼容性强,具备高特异性扩增、高检出率的特点。
2. 超高特异性,保证了Ct值的真实性
图2. Hieff® Unicon Power预混液扩增高度特异,Ct值结果可信度高 以1 ng人gDNA为模板,使用不同品牌预混液按照标准扩增程序,扩增5个目的基因片段,经琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物情况。结果显示Hieff Unicon® Power预混液针对不同靶标基因均可以高特异性扩增,得到最可信的靶标片段Ct值。
3. 检测范围宽广,模板添加不再纠结
图3. Hieff® Unicon Power预混液可有效检测6个数量级范围的模板量 以质粒DNA为模板,10倍梯度稀释(107-101 拷贝/μl),扩增IL23R基因。结果显示Hieff Unicon® Power预混液扩增特异,线性相关性高,可在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。
4. 良好的稳定性,让体系配制更加灵活: 图4. Hieff® Unicon Power预混液及其配制体系稳定性俱佳 以1 ng 人gDNA为模板,使用Hieff Unicon® Power预混液在不同冻融次数或体系配制后4℃放置不同时间条件下,检测TFRC基因扩增情况。结果显示Hieff Unicon® Power预混液经50次反复冻融或体系配制后4℃保存24h,扩增性能无变化(溶解曲线图数据未做展示)。
5. 兼容快速程序与标准程序: 图6. Hieff® Unicon Power预混液让扩增时间大大缩短 以1 ng人gDNA为模板,扩增不同GC基因片段(30-70%),比较Hieff Unicon® Power预混液在标准程序和快速程序下的扩增效果。结果显示Hieff Unicon® Power预混液可兼容快速扩增程序和标准扩增程序,使用快速程序可缩短扩增时间。
常见问题 Q:如何选择产品? A: 产品名称 货号 特异性 扩增效率 灵敏度 性价比 Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix 11195ES ★★★★★ ★★★★☆ ★★★☆☆ ★★★☆☆ Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix 11198ES ★★★★☆ ★★★★☆ ★★★★☆ ★★★★☆ Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix 11201ES ★★★★☆ ★★★★★ ★★★☆☆ ★★★★★
Q:Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix产品可应用于哪些实验? A:可用于对特异性要求比较高或较难实现特异性扩增的基因片段。这款产品极大程度上避免了引物二聚体、非特异性扩增的出现,特别适合于引物中有单个碱基不同的扩增。
Q:建议的模板加入量? A:20 μL反应体系,未经稀释的cDNA加入量建议不超过2 μL。
Q:试剂如何储存及保质期? A:建议-20℃保存,有效期1年。
订购信息 产品名称 货号 规格 价格(元) 促销价(元) Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法,No Rox) 11195ES08 5 ml 1653.00663.00
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法,Low Rox) 11196ES08 5 ml 1653.00663.00
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法,High Rox) 11197ES08 5 ml 1653.00663.00
相关产品 产品名称 货号 规格 价格(元) 促销价(元) Hifair® II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) 11123ES60 100 T 955.00
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox ) 11201ES08 5 ml 740.00 498.00 Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus) 11202ES08 5 ml 740.00 498.00 Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus) 11203ES08 5 ml 740.00 498.00 HB190306 |
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