制备siRNA有多种方法，比如化学合成、体外转录、siRNA表达载体以及PCR表达组件等。但无论使用哪种方法，设计siRNA的第一步都是选择siRNA靶位点。这里提到的siRNA靶向位点选择指导准则是基于现有文献以及Ambion的科学家的经验观察所总结的。根据该指导准则进行操作，大约半数的siRNA会使得目标mRNA水平降低50%以上。

通过专利的siRNA设计流程，Ambion已经针对超过35,000个基因（人、小鼠及大鼠）设计了siRNA。关于这些高效siRNA的更多信息，请访问我们的Silencer Select siRNA信息页面。如要订购Silencer Select Pre-designed or Validated siRNA，可以先在我们的siRNA数据库中进行搜索。Silencer Select Pre-designed or Validated siRNA可确保沉默效果，且仅由Ambion/Applied Biosystems提供。

如果您希望设计自己的siRNA，可根据以下指导准则从不同物种中选择siRNA靶向位点。然后，通过化学合成、体外转录、载体或PCR产物表达等方式进行制备相应的siRNA。

1. 在靶向mRNA序列中找到一段21 nt的以AA二核苷酸起始的序列。

这种选择siRNA靶向位点的方式是基于Elbashir等人的观察 (1) 设计的，他们发现，3’端带有UU二核苷酸悬臂的siRNA最为有效。该方式同样与使用RNA pol III来转录发卡siRNA相符，因为RNA pol III会在4-6个核苷酸poly(T)处终止转录，从而得到带有短poly(U)尾的RNA。

在Elbashir的论文及后续发表的论文中，带有其他3’端终止双核苷酸突出的siRNA已被证明可以有效诱导RNAi。若需要，您还可以对这种靶向位点选择方式进行修改，以设计带有其他双核苷酸突出的siRNA，不过一般建议避免选择GG突出末端，因为siRNA在单链G残基处可能被RNase剪切。

2. 选择2-4个靶向序列

3. 设计恰当的对照

最初使用siRNA表达载体来诱导RNAi的研究人员对于他们编码表达siRNA的插入片段有不同的设计准则。大多数设计均具有两段反向的重复序列，之间由短间隔序列隔开，然后以一系列T作为结尾用于转录终止。这些设计得到的RNA转录本预计会折叠为如图1所示的短发卡结构siRNA。siRNA靶向序列的选择、编码发卡结构的茎（stem）既反向重复序列的长度、反向重复序列的顺序、编码发卡结构的环（loop）的间隔序列的长度及组成，以及是否带有5’端突出等设计要点，在不同报告中有着很大不同（3-11）。

Ambion推荐的siRNA发卡设计程序 下文所述siRNA发卡设计及克隆方式的建议是基于Ambion的科学家的研究工作而给出的。设计合适的插入片段的第一步是根据上文“一般设计指导准则”的所述步骤来选择siRNA靶向位点。

要进行筛选，我们一般会对每个目标片段测试4条不同的siRNA序列，在基因序列的全长上将siRNA序列间隔开，以降低mRNA靶定区域高度结构化或与调控蛋白相结合的可能性。由于针对每个靶基因构建和测试四个siRNA表达载体要花费大量时间，我们发现使用基于PCR的siRNA表达组件（SEC）来筛选潜在siRNA序列要更容易。SEC是一种在发卡siRNA模板两侧带有启动子和终止子序列的PCR产物。这种筛选方法还可以鉴定实验体系中启动子和siRNA序列间的最佳组合。可以高效引起基因沉默的SEC可以快速克隆至载体中以用于长期研究。Ambion的科学家已经确定，一段序列如果作为siRNA直接转染能很好地发挥作用，在体内表达为siRNA的话同样能起到很好的效果。唯一的例外是体内表达的siRNA序列不能包含4个或5个连续的A或T，因为这会成为聚合酶III的转录终止位点。

对于传统的克隆至pSilencer载体的方法，需设计两条编码所选siRNA序列的DNA寡核苷酸以插入到载体中（图2和图3）。一般来说，这种DNA寡核苷酸需要含有19个核苷酸长的正义siRNA序列，并通过一条短间隔序列与其反向互补的反义siRNA序列相连。Ambion的科学家已成功地使用了9个核苷酸的间隔序列（TTCAAGAGA），当然也可设计其它的间隔序列。在寡核苷酸的3’末端需要添加5-6个T。另外，为了将片段克隆至pSilencer 1.0-U6载体，在DNA寡核苷酸链的5’和3’端需要分别添加EcoR I和Apa I限制性内切位点的核苷酸突出（图2）。相应的，如果要克隆到pSilencer 2.0-U6、2.1-U6、3.0-H1或 3.1-H1载体时，则需要在DNA寡核苷酸链的5’和3’端分别添加BamH I和Hind III限制性内切位点的核苷酸突出（图3）。最终获得的RNA转录本应当会发生折叠并形成茎环状结构，由19bp的主干和9nt的环以及3’端2-3个U所组成（图1）。

要将片段克隆至pSilencer腺病毒1.0-CMV载体，带茎环结构的DNA寡核苷酸可依照如上文所述的pSilencer 2.0和3.0载体中那样来设计。然而，值得注意的例外情况是，对于基于CMV的载体系统，其寡核苷酸的3’末端没有5-6个T，因为基于CMV的载体系统，其转录终止信号是SV40 polyA。另外，为了将片段克隆至pSilencer腺病毒1.0-CMV载体，在DNA寡核苷酸的5’和3’末端分别添加了带有Xho I和Spe I限制性内切位点的核苷酸悬臂（图4）。不过，对于要克隆至pSilencer 4.1-CMV载体的片段，其5’和3’末端则分别添加了带有Bam H1和Hind III限制性内切位点的核苷酸悬臂（图5）

siRNA标靶的筛选

除了我们独有的专利算法及我们建议的siRNA标靶筛选程序（即对mRNA序列进行扫描以找出AA双核苷酸，并记录下AA下游的19个核苷酸），其他研究人员还使用了两种不同的方法。在第一种方法中，siRNA靶向序列的选择是纯粹依赖经验而决定的 (4)，只要求目标序列以GG起始，且通过BLAST搜索分析与其他基因不具有明显的序列同源性。

在第二份报告中，研究人员使用了更详细的方法来选择siRNA靶向序列。该筛选程序利用了内源性mRNA的任何可接触位点均可以通过合成寡脱氧核苷酸/RNase H的方法来识别并降解这一现象 (5)。用这种方式所鉴定出的任意可接触位点可以作为插入序列用于构建U6启动子驱动的siRNA表达载体的构建。

发卡siRNA中正义链和反义链的顺序

发卡siRNA表达组件通常依次包含目标正义链、短间隔片段和目标反义链。有研究团队发现反转siRNA表达构建中的正义和反义链顺序不会影响到发卡siRNA的基因沉默活性 (6)。与此相反，另一个研究团队则发现对另一个siRNA表达组件的顺序进行类似反转会造成发卡siRNA基因沉默活性的部分降低 (7)。造成这种现象的原因尚不清楚。目前，仍建议在构建siRNA表达组件时遵循正义链、短间隔序列、反义链的排列顺序。

siRNA茎干的长度

目前看来，用作siRNA表达组件中茎干的核苷酸序列长度可以有某种程度上的变化。包括Ambion在内的几个研究团队使用19个核苷酸长度的序列作为siRNA表达组件的茎干部分 (6-10)。与此相反，其他研究团队则使用从21个核苷酸长度 (4-5) 到25-29个核苷酸长度 (11) 的siRNA茎干序列。研究发现这些具有不同茎干长度的发卡siRNA在基因沉默研究中均表现良好。

发卡siRNA中连接正义链和反义链的环的长度及序列

很多研究团队报告了使用环大小范围从3至23个核苷酸的发卡siRNA成功进行基因沉默的结果（4、6-9、11）。下表是不同研究团队所用环大小及具体序列的总结：

发卡siRNA中5’悬臂的存在

大多数研究团队在发卡siRNA构建中并未使用5’悬臂（4-8、10-11）。然而，有一个团队在发卡siRNA构建中使用了6个核苷酸长的5’悬臂 (9)。这种带有5’悬臂的发卡siRNA在基因沉默中工作正常。

Ambion可以对用户自行设计的siRNA及使用Cenix算法预设计的siRNA进行合成。

要订购您已经设计好的化学合成siRNA，您可以提供以下信息中的任意一项：

或

Ambion会依照您的序列合成一对互补的siRNA寡核苷酸。若您仅提供了mRNA标靶序列，我们将默认合成带有dTdT的3’端悬臂的siRNA。若您希望，也可选择UU或其他悬臂。我们的科学家在带有dTdT或UU悬臂的siRNA的效能间没有观察到任何功能性差异。（注意：正义链的3’端dTdT无需与目标基因互补。）

目前，Ambion可对NCBI所维护的RefSeq数据库中所有人、小鼠及大鼠基因中的98%以上的基因提供 预设计siRNA 。要订购预设计siRNA，您可在我们的siRNA数据库中搜索您感兴趣的基因，选择您希望订购的设计，将它们添加至购物车中，然后将每条siRNA的相关信息填写在我们的在线oligo订购表上。关于设计所用算法的相关信息，请参见“设计更好的siRNA”。

要通过体外转录、siRNA表达载体，或通过PCR得到的siRNA表达组件来制备siRNA，首先需要准备合适的模板。对于如下Ambion试剂盒/产品，可使用在线工具设计模板：

这些工具还可以通过上文所述siRNA Target Finder来获取。

2. Editors of Nature Cell Biology (2003) Whither RNAi? Nat Cell Biol. 5:489-490.

3. Brown, D., Jarvis, R., Pallotta, V., Byrom, M., and Ford, L. (2002) RNA interference in mammalian cell culture: design, execution, and analysis of the siRNA effect. Ambion TechNotes 9(1): 3-5.

4. Sui, G., Soohoo, C., Affar, E.B., Gay, F., Shi, Y., Forrester, W.C., and Shi, Y. (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. US A 99(8): 5515-5520.

5. Lee, N.S., Dohjima, T., Bauer, G., Li, H., Li, M.-J., Ehsani, A., Salvaterra, P., and Rossi, J. (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology 20 : 500-505.

6. Yu, J.-Y., DeRuiter, S.L., and Turner, D.L. (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9) : 6047-6052.

7. Paul, C.P., Good, P.D., Winer, I., and Engelke, D.R. (2002) Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnology 20 : 505-508.

8. Brummelkamp, T.R., Bernards, R., and Agami, R. (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296 : 550-553.

9. Jacque, J.-M., Triques, K., and Stevenson, M. (2002) Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature 418 : 435-438.

10. Miyagishi, M., and Taira, K. (2002) U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs effectively suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnology 20 : 497-500.

11. Paddison, P.J., Caudy, A.A., Berstein, E., Hannon, G.J., and Conklin, D.S. (2002) Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Devel. 16: 948-958.