TRIzol 作用原理

● TRIzol 法的优点：

RNA 抽提前的准备

● 试剂耗材准备：

● 样品准备：

RNA 抽提流程

● RNA 抽提操作

RNA 质量检测

1、分光光度计测定：Nanodrop 2000、Agilent 2100

2、凝胶电泳法：

配制 1.2% 琼脂糖凝胶。将样品加上 RNA loading buffer 后加入上样孔电泳。电泳液用新鲜的 1×TAE 即可。 ◆ RNA loading buffer 配方：

紫外下拍照可以看见 3 条带，从上往下依次是 28s RNA、18s RNA 和 5sRNA。其中 28s RNA (5kp) 应为 18s RNA 亮度的 2 倍且没有涂抹状条带，这样的 RNA 质量是过关的。

吸光度测定法来不能区分 DNA 和 RNA，而电泳法如果看到上样孔内亮亮的，那通常为污染的 DNA。如果 DNA 会干扰后续实验，可以用 DNase 消化去除。

可以通过与 marker 比较估计 RNA 含量。(marker 通常会告诉上多少量的 marker，最亮条带相当于多少量的 DNA，例如 DNA marker 最亮条带是 1ug，上样量约 1.5ug, 因此将 RNA 条带亮度与 marker 对比，可大概得知 RNA 的量。）

01 反转录

反转录实验原理：

根据不同情况选择不同的反转录引物： （1）RNA 有 polyA 尾：用 Oligo(dT) 作为反转录引物，要求 RNA 质量好，否则 poly(A) 尾可能降解，造成全长 cDNA 合成量大大减少。 （2）RNA 没有 polyA 尾：如原核生物 RNA、真核生物的 rRNA、tRNA，用随机引物 (Random primer) 作为逆转录引物。（几乎所有 RNA 都可以用随机引物来反转） （3）目的序列已知时，用与模板序列特异性互补的引物作为反转录引物。

★ 推荐试剂盒：TOYOBO ReverTraAce -α- (FSK-101 100 reactions)

试剂盒中的反转录酶经过突变改造： ◆ 反转录酶主要功能结构域：polymerase 结构域（负责 cDNA 合成）、RNase H 结构域（降解 RNA）。因此，野生型的反转录酶转录出的产物是单链 cDNA。 ◆ 突变的反转录酶失去了 RNase H 的功能，使得 RNA 不被降解，得到的产物是单链 cDNA 和 RNA 的杂合链。

反应体系配制及 PCR 条件设置：

02 PCR 扩增

★ PCR 酶和 PCR 体系

推荐试剂 1：TaKaRa Premix TaqTM (TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye)(RR901A 性能普通，适合目的基因好扩的）

◆ 2×mixture，包含酶、buffer、dNTP、Mg2+，使用方便，配制体系前充分混匀。 ◆ 已含有染料，跑完 PCR 后不需要再加 loading buffer。 ◆ Taq 酶冷启动：在冰上配制反应体系。

推荐试剂 2：TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase (RR001Q) 冷启动

推荐试剂 3：TaKaRa Ex Taq Hot Start Version (RR006Q) 热启动，特异性好，便宜。

★ PCR 程序设置

03 PCR 产物检测

出现涂抹状条带的原因： ① Mg2+加多了，导致酶活性异常。商品化的试剂一般不存在这个问题。 ② 电泳缓冲液不新鲜，需要更换了。

出现引物二聚体的原因： 引物设计不好：引物设计时，应保证产物大于与引物二聚体，保证电泳结果可以明显区分出来； PCR 条件设置不好，导致引物不能很好的结合到模板。

50×TAE 配方：

RT-PCR 出问题的原因

1、无扩增产物：

可能原因 1：引物问题（包括：引物设计较差，引物合成较差，引物浓度太低）。 解决方法：设计引物的时候，避免在引物 3’端含有互补序列；避免可以形成内部发卡结构的序列；设计 Tm 类似的引物。针对引物合成的问题，用普通电泳法，看引物的设计和合成质量，是否有目的条带出现。最佳引物浓度介于 0.1μM 到 0.5μM 之间。

可能原因 2：探针问题。 解决办法：用 blast 对探针序列进行比对，设计符合要求的探针。

可能原因 3：模板问题（包括：模板质量不好，模板浓度太低）。 解决方法：提高模板质量。如果怀疑模板被 DMSO 等抑制剂污染了，坚决采用乙醇沉淀；使用 104copy 的靶序列，然后在 25 到 30 个循环中获得信号。

可能原因 4：不明物干扰。 解决办法：做 RT-PCR 必须非常小心翼翼。对 RT-PCR 的任何实验样品或试剂，均应采用“三无”离心管（即无菌无酶无热源）进行试剂的分装和使用。

可能原因 5：扩增酶问题。 解决办法：不要省钱。买好的扩增酶。分子生物学永远是一分价钱一分货。推荐：选择 hot start Taq 酶进行扩增，可提高灵敏度，增加产量，降低干扰因素。

2、非特异信号：

可能原因 1：引物问题（包括：引物二聚体太多）。 解决方法：检查引物设计环节和合成环节，必要时重新设计和合成引物。

可能原因 2：扩增酶问题。 解决办法：选择 hot start Taq 酶进行扩增，可提高灵敏度，增加特异性。

可能原因 3：检测温度太低。 解决办法：在更高的温度下检测荧光信号。这个时候，引物二聚体已经解链。

3、灵敏度低：

可能原因 1：RNA 问题（包括：RNA 被损害和降解；初始模板 RNA 不充分）。 解决方法：如果完全损害或者降解的话，更换 RNA；增加模板 RNA 的浓度；使用 10ng-1μg 的总 RNA。

可能原因 2：仪器故障。 解决方法：检查扩增仪的温度；检查荧光仪器温度和信号。如果发现故障，找厂家来修。

可能原因 3：PCR 扩增无效。 解决方法：反转录的抑制剂有很多，包括 SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺等等。一定要注意，不要被这些抑制剂污染了。

引物设计流程

引物设计操作

找模板序列：以 TP53 为例，只看确定的转录本，不看预测的。 方法 1）：NCBI-Nucleotide 中搜索目的基因的 transcript （人）→ CDS → 保存 .seq 文件 方法 2）：NCBI-Gene（任意物种）→ Refseq RNA → transcript → CDS → 保存 .seq 文件 2. 找 CDS 保守区域： DNAMAN → Sequence → Alignment → Multiple Sequence Alignment → File 打开 seq 文件 → 下一步×3，完成 → 取白字黑底序列（所有转录本共有的保守序列）保存或贴到 Oligo 里（选中序列 → Edit → Copy → text）。

设计引物：Oligo 6 输入序列 → Accept → 选择 Tm 框Melting Temperature → Change → Current Oligo Length 修改引物长度（常用 23-24bp） → Tm 框里搜索合适引物，用 Upper 和 Lower 选定。 ◆ 设置引物长度 ◆ 肉眼搜索引物： ① 平均 TM 值在 72℃ 左右（下面两条虚线之间。Taq 酶在 72℃ 进行 DNA 复制，DNA 解链，引物与 DNA 单链结合） ② 5’端 TM 值高于 3’端（因为合成方向是 5’-3’，即 3’端会攻击 DNA 链使得引物与 DNA 链结合，能量越低越容易发生攻击反应。） ◆ 选择引物位置

评价引物：上下游引物的 Tm 值要相近（72℃左右），可以通过修改引物长度（Change → Current Oligo Length）来调整。 ◆ 查看引物参数：Analyze → PCR ◆ 框框里出现提示信息怎么办？ ① 3'-end dimer between the primers. 引物间有二聚体，那就随意挑一条引物挪动几个碱基; ② Two-temperature PCR-recommened: (68°/94°) 有两个可用的温度，那就还是随意挑一条引物挪动； ③ Terminal stability of the Lower Primer is too high. 下游引物的一端稳定性太高，那就是说这条引物的碱基对应着的柱子高了，把它往柱子低一点的地方挪； ④ Terminal stability of the Upper and Lower Primers is too high. 上下游引物的末端稳定性都太高，那就把两条都挪往低一点的地方。

保存引物：两种方法 （1）Edit → Upper Primer/Lower Primer → Ctrl+C，Ctrl+V （软件会自动按 5’-3’方向显示引物序列）贴到 excel 表里（填引物订单时）。 （2）File → Save 保存成 .seq 文件。

BLAST 一下确认引物是否会扩增出其他基因（确保正反向都只能扩出目的基因），不能则可以合成。 参考：3款简单实用的在线PCR引物设计软件 搜索关键词：NCBI blast 引物验证

引物设计要点

RT-qPCR

● RT-qPCR：以 cDNA 为模板进行 PCR，在 PCR 扩增过程中，通过收集荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。

在实时 PCR 扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和 Ct 值。

● SYBR Green 法原理 参考：SYBR Green I 法原理/优缺点/常见问题解析

RT-qPCR 操作流程

RT- qPCR 实验操作要点

1、引物设计 除了遵循一般的引物设计原则外，需要注意产物长度应控制在 80-150bp。 片段越短扩增效率越高，但若小于 75bp 则无法与潜在的引物二聚体区分，从而给判断引物优劣带来障碍。 推荐：PrimerBank、Oligo6、paper 参考：3 款简单实用的在线 PCR 引物设计软件

2、Mix 配制 推荐试剂：DBI Bioscience Bestar® Sybr Green qPCR Master Mix （热启动） ◆ 根据所用 MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。注意是否添加 ROX（校正染料）。 ◆ MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在 4 度。 ◆ 冰上操作。 ◆ 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！减少加样误差！ ◆ 所有成分加完后，离心去除气泡（以免气泡影响荧光信号收集）。 ◆ 每个样品至少 3 个平行孔。

ROX（Passive Reference Dye）是一种惰性参比染料，在 qPCR 反应中能被 qPCR 仪检测到。ROX 不参与 qPCR 反应，荧光信号值不会随着 qPCR 扩增而改变。实验过程中很多因素会引起孔间差异：不均匀的照明，孔与孔之间光学因素（液滴、气泡）的因素，反应体系的浓度不同…… 可以用 ROX 作为阳性参比，对其他荧光信号进行归一化校正，以提高数据的较精确度。

Real-time qPCR 数据分析——（1）相对定量

● 相对定量：检测实验组和对照组中一个靶基因的倍数差异。

★ 相对定量计算方法：

常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法，ΔCt 法，2-ΔΔCt 法 (Livak 法），用参照基因的 ΔCt 法和 Pfaffl 法。

ΔCt 法：不用内参基因作为标准，实验设计简单，数据分析处理简单。需要准确量化初始材料（如细胞数目或核酸微克数），扩增效率为 100%。计算公式如下：

2-ΔΔCt 法：这是最常用的进行相对基因表达分析的方法，得到的结果是实验组中目的基因相对于对照组中目的基因表达的差异倍数。要求目的基因和内参基因的扩增效率都接近 100%，且相对偏差不超过 5%。计算公式如下： Step1：用内参基因 Ct 值对实验组 (test) 和对照组 (con) 的靶基因 Ct 值归一化： ΔCt test = 实验组目的基因 Ct 值- 实验组内参基因 Ct 值 ΔCt con = 对照组目的基因 Ct 值- 对照组内参基因 Ct 值 Step2：用对照组的 ΔCt 值归一化实验组的 ΔCt：ΔΔCt = ΔCttest-ΔCtcon Step3：计算表达水平的差异倍数：Change Fold = 2-ΔΔCt

用参照基因的 ΔCt 法：这个方法的使用前提与 2-ΔΔCt 法相同。计算方法： ◆ 这种方法得到的对照组表达水平不是 1.0，但如果将得到的两个表达值都除以对照组表达值，则得到： 得到的比值与 2-ΔΔCt 法是相同的，因此 用参照基因的 ΔCt 法是 2-ΔΔCt 的一种变化形式。

Pfaffl 法：当目的基因扩增效率 (E target) 和内参基因扩增效率 (E ref) 不同，但每个基因在实验组和对照组扩增效率相同时，可以按下列计算公式确定表达差异。2-ΔΔCt 法是 Pfaffl 法的简单特例。

Real-time qPCR 数据分析——（2）绝对定量

参考：干货|绝对定量之 DNA 拷贝数计算

● 绝对定量：是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。

● 如何使用标准曲线进行绝对定量？ 在进行绝对定量前，我们首先需要使用已知浓度的模板建立标准曲线，这可以通过梯度稀释已知样品，使用这些稀释的样品作为标准品来构建标准曲线。

Real-Time qPCR 常见问题分析

参考：qPCR 常见问题及解决方案

1、无 Ct 值出现

2、Ct 值出现过晚（Ct>38）

3、标准曲线线性关系不佳

4、负对照有信号

5、溶解曲线不止一个主峰

6、扩增效率低

7、同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？

8、扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？