来源：雪球App，作者： 江苏耀海生物CDMO，（https://xueqiu.com/9950954021/273218220）

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体外转录RNA（IVT RNA）包括mRNA、circRNA、saRNA，近年来在预防和治疗型生物制剂的开发中备受关注。IVT作为一种常见的RNA体外合成策略，可以协助我们高效地获得目标转录本。而质粒作为IVT RNA的常用模板，其序列的深度解析和合理设计是必不可少的。

服务于mRNA的质粒模板应满足以下需求：首先是目标RNA编码序列，即UTR、CDS和polyA。其实是质粒功能元件，包括复制起点（ori）、启动子、线性化酶切位点、抗性基因，以具备自我复制和选择性筛选的功能，并能够转录生成特定长度的RNA转录本。

今天这篇文章我们将聚焦于IVT RNA质粒模板的功能元件和设计策略。

图1: IVT RNA质粒模板示意图

IVT RNA质粒模板序列设计全解析

1.复制起点（ori）

复制子是质粒的一个基本要素，由复制起点(ori )与其他元件组成，例如参与复制起始的蛋白编码序列。其中ori是支持质粒自主复制的最小顺式作用区。ori区域富含A-T碱基，相比连接C-G的3个氢键，A-T由2个氢键连接，更容易解链。ori序列一旦发生解链，即开始质粒的复制过程。

复制起点的调控是拷贝数的主要影响因素，常见的细菌复制起点包括ColE1、pMB1、pSC101、R6K和15A。一般来说，质粒的复制特性包括“严紧型”或“松弛型”，严紧型质粒受宿主RNA或蛋白质合成的严格调控，属于低拷贝质粒；而松弛型质粒不受严格控制，属于高拷贝质粒。将复制子序列进行突变，可以改善控制类型。例如，pMB质粒的ori在每个细胞中能保持约20个拷贝，而 pUC质粒的ori存在两个突变，在每个细胞中能产生高达700个拷贝。有些ori的扩增能够由抗生素诱导，进一步提高质粒拷贝数。

图2: 常见质粒载体的ori及对应的拷贝数

2 启动子（Promoter）

转录模板上的启动子序列被RNA聚合酶（RNAP）识别，随后在RNAP作用下将DNA转录为RNA。因此，在mRNA编码序列的上游必须匹配对应的启动子序列。IVT反应常用的RNA聚合酶包括T7、T3和SP6，可以获得长达几千碱基以上的RNA转录本，而且可以实现高产量。

来源于T7噬菌体的T7 RNA聚合酶具有较高的特异性和RNA合成活性，是最常用的RNA聚合酶。与之对应的，使用最广泛的T7启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGGAGA。据报道，启动子下游的序列可能会影响 T7 RNA聚合酶的活性，基于下游序列定制化优化启动子序列可能会增强转录。T3 RNA聚合酶来源于T3噬菌体，常用的T3启动子序列为AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA。由于启动子序列的相似性，T3 RNA聚合酶可以识别T7启动子合成mRNA，但转录效率大幅降低；反之亦然。SP6聚合酶来源于SP6噬菌体，针对SP6启动子序列具有高度特异性。

以常用的T7启动子“TAATACGACTCACTATAGGG”为例，T7 RNA聚合酶以互补链为模板，从5'->3'的方向开始转录，转录本中的第一个碱基将是G。另一点需注意的是，选择共转录加帽方案时，应结合帽类似物优化T7启动子序列。

3 酶切位点

如果以环状质粒DNA为模板，基于RNA聚合酶的体外转录不会在预想的末端终止，而是产生长度不一的转录本。使用限制性内切酶在目标基因的下游进行切割，能够避免RNA聚合酶的过度转录。因此，我们应在质粒模板的mRNA编码序列的下游合理设计线性化酶切位点。

IIS型限制性内切酶是mRNA转录模板线性化的首选酶，例如常见的BspQⅠ、BsaⅠ。这是因为IIS型限制性内切酶的切割位点在识别序列之外，不会留下多余的核苷酸，可以确保polyA尾的完整性。值得注意的是，待转录的序列不能含有所用线性化酶切位点，以免产生截短的mRNA。

图3: 常见IIS限制酶酶切位点

4 抗性基因

抗性基因对于阳性克隆的筛选和质粒的维持至关重要。质粒转化为大肠杆菌是一个低效的过程，因此需加以抗性基因等选择性标记筛选含有目标质粒的重组菌落。此外，从细菌生长的角度来看，质粒的存在可能是不利的，因而会导致一定程度的质粒丢失，而添加抗生素能够维持质粒的存在。

《中华人民共和国药典》明确要求，除另有规定外，不得使用β-内酰胺类抗生素。为降低使用 β-内酰胺类抗生素带来的风险（包括排放相关的环境污染和制品中残留引起患者过敏的风险），在早期构建载体时应尽量避免使用此类抗性基因。因此，如有产业化需求，我们建议在IVT RNA质粒模板的序列设计阶段避免使用β-内酰胺类抗生素基因，如氨苄青霉素。

基于在mRNA制备方面的开创技术和丰富经验，耀海生物可为全球客户提供mRNA一站式制备服务，涵盖DNA模板序列设计、IVT mRNA制备、mRNA纯化、mRNA冻干、LNP包封、mRNA质量检测。

耀海生物还提供各种预制型质粒模板（质粒+菌液）、以及IVT mRNA产品（原液/冻干粉）、LNP成品，编码蛋白涵盖报告基因、靶点蛋白、基因编辑蛋白和抗原蛋白，包括eGFP、mCHERRY、luciferase、IL-2、Cas9、OVA、新冠S蛋白等，以满足不同的实验或项目需求。

eGFP mRNA和mCherry mRNA在293T细胞中实现高表达

参考文献

[1] Williams DJ, Puhl HL, Ikeda SR. A Simple, Highly Efficient Method for Heterologous Expression in Mammalian Primary Neurons Using Cationic Lipid-mediated mRNA Transfection. Front Neurosci. 2010 Nov 4;4:181. doi: 10.3389/fnins.2010.00181.

[2] 网页链接

[3] Kang DD, Li H, Dong Y. Advancements of in vitro transcribed mRNA (IVT mRNA) to enable translation into the clinics. Adv Drug Deliv Rev. 2023 Aug;199:114961. doi: 10.1016/j.addr.2023.114961.

[4] Pingoud A, Wilson GG, Wende W. Type II restriction endonucleases--a historical perspective and more. Nucleic Acids Res. 2014 Jul;42(12):7489-527. doi: 10.1093/nar/gku447.