Q1：DNA 产量低

A1：（1）质粒拷贝数：

载体因拷贝数差异会造成质高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动，(每毫升培养过夜的菌液，高拷贝数的粒产量明显的波动。质粒载体产量为3-16 μg)。长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5~2 μg；

◇低拷贝质粒：pBR322, pACYC 及其衍生载体，pSC101 及其衍生载体，SuperCos, pWE15；

◇高拷贝质粒：pTZ, pUC, pBS, pGM-T；

（2）大质粒(> 10 kb)：

长片段质粒常以中低拷贝数为主，可提升菌液添加量至200 - 300 ml 以提高产量，同时按照比例增加Buffer P1、Buffer P2、Buffer P4 的用量，洗脱缓冲液Buffer TB 应在55℃ 水浴锅预热，同时在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率，其他步骤相同；

（3）菌种问题：

菌种保存过程中存在质粒丢失现象，培养细菌前最好先划线活化，以稳定产量；

（4） 细菌未充分裂解：

细菌须在Buffer P1/RNase A 中充分重悬，成团的细菌因无法裂解会降低产量；

（5） 试剂准备有误：

Buffer P2在低温时有沉淀析出，需加热溶解或放置37℃ 恒温箱中至清亮方可使用。Buffer PW 加入乙醇体积不准确(乙醇浓度需控制在80%)；

（6）将Elution Buffer 预热至55℃，并重复二次洗脱。

Q2：基因组污染

A2：(1) 培养时间太长：

菌液培养时间需控制在12-16 h；

(2)裂解问题：

加入Buffer P2 时，必须轻柔颠倒混匀；处理多个样品时，从加入Buffer P2 时算起，总时间不要超过5 min。

Q3：下游结果不理想

A3：（1）盐污染：

确保用Buffer PW2 洗涤两次；

（2）乙醇污染：

在最后一次Buffer PW2 洗涤后可将吸附柱离心时间延长，DC201由原来1 min 增加至2 min，DC202由原来3 min 增加至5 min；

（3）质粒降解：

用endA+ 的菌株如HB101 或其它野生型菌株，含有高丰度的核酸酶，必须加入Buffer PW1；

（4）膜脱落：

在洗脱质粒时硅胶膜在离心过程中可能会发生脱落。10,000 g 离心2 min 后再把质粒转移至新的离心管中；

（5）RNA残留：

① RNase A 可能出现酶活下降：

加入RNase A 的Buffer P1 在4℃ 中放置超过3个月时，可能会出现酶活下降，重新使用时，可在相应的P1 中补充加入10 mg/ml 的RNase A 至终浓度为100 μg/ml；

② Buffer P1 加量较少：

由于菌体悬浮后的浓度过大，导致Buffer P1中RNase A 不足以消化菌体中的RNA。

Q4：提取的质粒，进行电泳检测，会出现三条带，分别代表的是什么？

A4：一般来说提取的质粒有三种形态，电泳图从上而下分别是开环DNA、线性DNA和超螺旋DNA。如果提取的质粒污染比较严重，在电泳图上甚至还会看到宿主细胞的基因组和RNA污染。双螺旋质粒的含量是判断质粒提取效果的重要指标，双螺旋质粒的转染效率最高。在实际操作过程中，有时我们只能看到两条带，甚至是一条，可以通过单酶切线性化质粒和原始质粒同时进行电泳，线性化条带所处的位置指示的是质粒的实际大小，而根据相对迁移速度，来判断另一条条带是开环质粒还是超螺旋质粒。

Q5：提取质粒的产量？

A5：可快速提取 0.2-1.5mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80%-90%。

Q6：内毒素清除原理？

A6：内毒素清除剂能与内毒素特异结合，低温时不分层；高温化学键（氢键）断裂，亲水性下降，内毒素清除剂包裹着内毒素形成新的相，通过离心分层达到去除内毒素的效果。

注：核酸几乎不和内毒素清除剂结合。

Q7：内毒素清除离心后分层不彻底时，如何改善？

A7：（1）提升离心温度：当室温环境较低时，设置离心机的温度至30℃；

（2）加大离心机转速：由说明书中的12,000×g 提升至14,000×g；

（3）降低离心机降速：修改离心机降速参数至3左右；

（4）增加离心时间：由说明书中的10min增加至15min；

（5）离心后若有少量蓝色物质残留，可以将离心管稍加静置，即蓝色物质会彻底沉降。