作为一种多功能微生物，细菌是基因工程中的重要研究对象，利用基因编辑技术对其基因组进行特异性修饰在代谢工程和分子生物学研究中有着广泛应用。在枯草芽孢杆菌中，其基因组减少8%后，生理功能仅受到很小的影响[1]；甚至有研究表明，将恶臭假单胞菌的基因组减少3.76%后，菌株的生长速度和转化效率均有提高[2]；将大肠杆菌的基因组减少6%、8%或15%后，其生理特性并没有受到明显影响，而减少30%后，会引起细胞复制上的缺陷[3]。这些例子表明在实验室控制条件下，细菌基因组中有很大一部分不是必需的[3]。因此，对一些原核生物(例如：大肠杆菌) 的基因组进行改造来构建非天然合成途径或代谢途径以生产所需产物在系统代谢工程上有很大的应用价值。而随着分子生物学和测序技术的发展，人类基因及各种微生物基因得以解码，这些技术的发展让人工合成基因成为可能。2006年，Heinemann等[3]首次将人工基因网络的设计、小型基因组的重构、信号通路的重新编程以及代谢工程均称为“合成生物学”。合成生物学是通过引入异源基因，合成新的DNA和新的酶或激发新的相互作用来构建非天然途径[4]。除了将人工合成途径整合到生物体的基因组上来表达我们所需的产物(如新型抗生素[5])，还可根据不同的微生物类型进行相应的改造，以生产与其自然过量产生的代谢产物具有相同生物合成途径的化学物质[6]。

目前对原核生物进行基因编辑的系统主要分为3类：同源重组、位点特异性重组、基于人工核酸内切酶的基因组编辑技术(如：CRISPR/Cas9系统)。同源重组技术是发展较早，最为传统的一种基因编辑技术，它利用细菌自身所存在的同源重组在人为干预下完成异源基因的敲入或敲除。位点特异性重组也是基于同源性所进行的一种重组技术，与前者不同的是，它可以在基因组的特异位点进行改造，但是在最后会有特殊位点的残留。CRISPR/Cas9技术出现后被广泛应用于真核生物的基因编辑，后来有研究者将其应用于原核生物，使原核生物的基因编辑技术有了新的选择。但是每种技术都存在着缺陷。近年来，越来越多的研究者选择将这几种基因编辑技术联合使用，大大提高了基因编辑的效率。在基因编辑的过程中，微同源序列(microhomology) (1–8 nt) 对于大肠杆菌天然末端连接(E. coli native end-joining, ENEJ) 至关重要[7]，即在大肠杆菌基因组修复过程中至少需要1–8 nt的同源序列。所以在很多基因编辑技术中，Red同源重组常常参与其中，与其他技术共同完成基因编辑过程。

大肠杆菌是目前研究得最清楚、分析得最透彻的一种微生物，早在20世纪90年代就已经完成了大肠杆菌基因组的测序[8-10]。尽管仍有很多基因的功能尚不明确，但由于其来源清楚，易于在基因水平上进行操作，所以在基因工程中被广泛使用。

本文将主要介绍几种基因编辑方法以及它们在大肠杆菌基因编辑中的主要应用。

同源重组是原核生物获得遗传多样性的一种手段，是其基因组的主要进化机制之一[11]。同源重组包括RecA重组系统和Red重组系统。RecA重组系统是大肠杆菌自身存在的一种重组系统，由RecA蛋白和辅助蛋白(如RecBCD、RecFOR等) 组成，前者在基因重组及基因修复过程中起着重要作用[12]，RecBCD是一种多功能酶复合物，其中RecB具有核酸内切酶活性和3′→5′解旋酶活性，RecC可介导双链断裂并识别Chi位点，RecD具有5′→3′解旋酶活性[13]。该复合体辅助RecA完成基因重组及修复过程。而λ-Red重组系统是来自λ噬菌体的一种重组系统，1998年被首次应用于大肠杆菌染色体改造[14]。该重组系统包括3种基因：redγ (gam)、redβ (bet) 和redα (exo)，分别编码Gam、Bet和Exo三种蛋白。Exo蛋白是一种由226个氨基酸组成的核酸外切酶[15] (分子量为24.9 kDa)，晶体结构显示：核酸外切酶在溶液中是环状三聚体，中间有一条通道，一端可以容纳双链DNA (double-stranded DNA, dsDNA)，另一端只能容纳单链DNA (single-stranded DNA, ssDNA)[15]。一旦与双链DNA结合，它将5′-链依次消化为单核苷酸，形成一个长长的3′-突出末端。Bet蛋白是一种由261个氨基酸组成的单链退火蛋白[15] (分子量为29.7 kDa)，它与ssDNA结合并促进互补链的退火。Gam蛋白不直接参与重组过程，而是和宿主RecBCD酶复合体结合并使其失活[15] (分子量为16 kDa)。2000年，Datsenko和Wanner[16]首次将这3种蛋白整合至pKD46，培养过程中，Exo蛋白发挥核酸外切酶活性，从5′-端消化目的片段，形成3′-突出末端(含同源臂序列)。在大肠杆菌DNA复制过程中，3′-突出末端的单链DNA序列与大肠杆菌基因组同源序列发生重组，将目的片段整合至大肠杆菌基因组(图 1A)。之后转入pCP20，该质粒含有温度敏感型复制起点和FLP重组酶基因，FLP重组酶可识别FRT位点，促使抗性基因两侧的FRT位点自身重组，从而将抗性基因消除(图 1B)，接着升高温度培养使该质粒自行丢失。由此完成基因修饰。

在同源重组过程中往往需要一定长度的同源臂。人们通常会通过PCR扩增方法在基因编辑模板两侧添加一定长度的同源臂，以便进行重组[16-19]。但是通过这种方式得到的线性DNA模板转入大肠杆菌后，容易遭受RecBCD核酸酶的降解，使重组效率和编辑效率大大降低[20]。而Red重组系统中的Gam可抑制宿主RecBCD核酸外切酶Ⅴ，从而防止电转过程中的线性DNA模板片段被破坏[21]，这样Bet和Exo便可结合DNA末端促进重组。此外，Red同源重组具有不受酶切位点限制、需要基因打靶同源臂短的优点[22]。

来自大肠杆菌Rac原噬菌体的RecE/RecT重组系统与λ-Red重组系统有些相似，且RecE/RecT和Redα/Redβ介导的重组在机制和功能上是等效的。二者均为核酸外切酶和单链退火蛋白的结合。RecE是一种5′→3′核酸外切酶，RecT是一种ssDNA结合蛋白，在体外可促进ssDNA退火、链转移和链入侵。另外，有研究指出两种蛋白的相对表达水平与重组效率密切相关。RecT表达水平升高会促进重组效率的提高，而RecE的过表达则不利于重组[23]。由于Redα/Redβ和RecE/RecT介导的重组均不需RecBCD活性，该研究者将其命名为Red/ET重组[24]。

之后有研究者运用Red/ET重组技术将来自短芽孢杆菌X23的伊短菌素合成途径基因片段(48.3 kb) 和来自解淀粉芽孢杆菌FZB42的芽孢菌霉素合成途径基因片段(37.2 kb) 整合到了枯草芽孢杆菌的染色体中，虽然无法检测到伊短菌素，但是成功表达出了芽孢菌霉素[25]。

位点特异性重组是DNA重组的重要方式之一，这种重组方式需要特定的位点特异性重组酶。该酶可识别DNA序列上的特定位点，然后剪切DNA双链并将其重新连接，由此来促进DNA序列的精确重排[26]。位点特异性重组可以分为几个简单步骤：(1) 重组酶结合两个重组位点；(2) 两个重组酶结合位点配对，形成带有交叉位点并列的突触复合体；(3) 重组酶催化裂解、链交换以及突触复合物中DNA的重新结合；(4) 突触复合物分解，释放出重组产物。经过以上过程可实现基因消除、基因插入以及基因倒置。位点特异性重组系统至少需要一种重组酶和一对重组位点。以loxP位点和Cre重组酶为例，图 2A展示了位点特异性重组的3种结果。

几乎所有已鉴定的位点特异性重组酶都属于以下两个家族之一：酪氨酸重组酶(tyrosine recombinase) 和丝氨酸重组酶(serine recombinase)，该命名方法是根据在反应中间体中形成共价蛋白质-DNA连接的氨基酸残基命名的。这两个重组酶家族的主要成员及其功能，以及这两种酶的结构特点在Grindley等[27]的综述中已总结。二者的重组机制截然不同。酪氨酸重组酶通过形成Holliday连接中间体成对地断裂并重新连接单链，从而实现链交换；而丝氨酸重组酶会切断所有链，通过双链断裂、180°旋转和重新连接实现链交换[27-28]。

目前常用的几种重组系统有：基于λ噬菌体整合酶(phage-encoded integrase, Int) 的Int/att重组系统[29-30]、基于酿酒酵母的FLP/FRT重组系统[31]、基于大肠杆菌噬菌体P1的Cre/lox系统[32-34]以及基于内源性Xer重组酶的Xer/dif重组系统[35]。

Int/att重组系统中的λInt重组酶属于丝氨酸重组酶，该酶可促进DNA上attP和attB两个位点间的重组形成新的位点attL和attR。该重组反应是不可逆的，这使DNA整合具有一定的稳定性，广泛应用于基因工程、基因治疗以及合成生物学等领域[36]。然而，另外一种噬菌体编码的被称为重组定向因子(recombination directionality factor, RDF) 的蛋白可与整合酶发生蛋白质-蛋白质相互作用，从而改变整合酶的特性，使其激活attL和attR重组而抑制attP和attB重组[37]。有研究将丝氨酸整合酶和其同源RDFs融合产生新的单一蛋白，该蛋白可高效催化attL和attR重组，而attP和attB重组效率降低[37]，证明了利用融合重组酶来完成DNA重组的可行性。

FLP/FRT重组系统和Cre/lox重组系统中的重组酶均属于酪氨酸重组酶。其中FLP/FRT重组系统经常和λ-Red重组系统结合使用，作为基因重组之后抗性消除的辅助手段[38-39]，但该方法存在耗时长的缺点，且重组后会有FRT位点残留。

Xer/dif重组系统中的重组酶有很多种，均属于酪氨酸重组酶，继XerC和XerD被发现后[40]，Le Bourgeois等[41]发现一些乳球菌和链球菌使用单一的酪氨酸重组酶XerS完成基因重组。之后，2013年，Leroux等[42]又在空肠弯曲杆菌中发现了XerH蛋白，它可催化质粒上的两个difH位点间的重组(图 2B)。XerH蛋白(354–362 aa)在大小和蛋白同源性上与传统的XerCD (298 aa)均有很大的不同，二者的同源性仅26%，但它与XerS (365 aa) 有着更高的相似性[43]。

虽然现在已经发现了多种重组酶，但目前关于一些重组酶，特别是丝氨酸重组酶的具体作用机制仍不清楚[27]，有待进一步研究。另外，所有位点特异性重组系统都存在一个问题，即重组之后基因组上会有一个位点的残留，在下次的基因整合中可能会发生预期之外的重组。

虽然Red同源重组可以对基因组的任意位置进行改造，但是缺乏特异性。很多研究者将同源重组与位点特异性重组相结合，从而对原核生物染色体的特定位置进行改造，但是，在进行染色体整合之后会留下一个重组位点(如FRT或loxp)，在以后的重组过程中可能会引起预期之外的重组结果[44]。所以，越来越多的研究者在探索一种无痕的基因编辑技术。如：将Red重组系统与Ⅰ-SceⅠ归巢内切酶相结合，从而得到了无痕编辑的效果[45-46]。

Ⅰ-SceⅠ是一个染色体的稀有内切酶，亦被称为归巢核酸内切酶，首先发现于酵母线粒体的内含子中。Ⅰ-SceⅠ识别18 bp的非对称序列(5′-ATTACCCTGTTATCCCTA-3′)，在染色体上加入这个序列可以被该酶识别并切割，诱导宿主体内的重组蛋白表达参与双链断裂(double strand break, DSB) 的修复，最终导致分子间的重组修复。该系统本质是基于传统的重组臂交换或非同源末端连接(NHEJ) 等分子机理以达到敲除基因组上特定DNA片段的技术。

Red重组与归巢核酸内切酶Ⅰ-SceⅠ的反选择相结合最多需要两步即可完成重组过程。第一，通过Red重组将目的片段整合到原核生物的染色体上，由此通过阳性选择标记即可筛选出阳性克隆；第二，Ⅰ-SceⅠ对其识别位点(阳性选择标记) 进行剪切，产生DSB，由于在阳性选择标记两侧含有相同的基因片段，之后在重组酶的作用下完成第二次的同源重组，从而将阳性选择标记去除，通过阴性选择可得到目的菌株(图 3)。由于该重组过程涉及两步同源重组，所以通常需要两个质粒。一般将重组酶基因和目的基因构建于质粒1，Ⅰ-SceⅠ归巢核酸内切酶基因构建于质粒2，且该基因通常由诱导型启动子来调控其表达，以便更好地控制整个重组过程。

2002年，Kolisnychenko等[45]首次结合Red重组和Ⅰ-SceⅠ归巢核酸内切酶相结合的基因编辑技术对大肠杆菌MG1655的基因组实现了无痕删减，使大肠杆菌基因组减少了8.1%，而对大肠杆菌生长速率并无明显影响，证明了该删除的基因岛对大肠杆菌来说是非必需基因。2006年，Tischer等[47]将Red重组技术和归巢核酸内切酶Ⅰ-SceⅠ的反向选择应用于大肠杆菌，完成了点突变、短片段及长片段的敲入和敲除。同时也证明了Ⅰ-SceⅠ归巢核酸内切酶的表达对整个重组过程起着至关重要的作用。2007年，Rivero-Müller等[48]将Red重组酶和Ⅰ-SceⅠ构建于一个质粒，分别用阿拉伯糖启动子和四环素启动子来调控其表达。最终实现了约3–55 kb的基因片段的敲入，且除目的基因外没有其他位点的残留。2014年，葛高顺等[46]通过巧妙地设计同源片段，利用基因打靶实现了无痕敲除大肠杆菌CLM37中的nanKETA基因簇，减少了唾液酸在大肠杆菌中的消耗[49]，对于在大肠杆菌内实现唾液酸化修饰有重要意义。但需要多次PCR扩增，实验过程较烦琐，且需要的无痕打靶片段长达684 bp，增加了实验成本。

以上几种方法都需要通过PCR在目的基因片段的两侧加入同源臂，从而将纯化的PCR回收产物通过电击转化进入菌株。为了简化实验过程，2016年，Hook等[50]结合基于噬菌体的位点特异性重组和λ-Red/RecET介导的同源重组创建了一种新的基因组编辑方法；他们构建了pGL2质粒，该质粒包含两个Ⅰ-SceⅠ酶切位点(用于消除复制起点)、φ80-attP位点(基因整合)、λ-attR/λ-attL位点(整合后抗性基因的消除) 及cat抗性基因(筛选标记)。该方法无需通过PCR扩增，而是通过质粒的相同酶切位点酶切及自我连接产生供体DNA片段。该方法最终实现了 > 10 kb的DNA片段的基因组整合，但是仍会在基因组上留下一段31 nt的残留序列。

关于阳性克隆的筛选过程，大部分是通过第一步的阳性选择和第二步的反向选择来筛选阳性菌株。2020年，Egger等[51]设计了一种更为简单的筛选阳性菌株的方法；他们将Ⅰ-SceⅠ识别位点整合到大肠杆菌基因组，构建了含有Ⅰ-SceⅠ识别位点的菌株BL21(DE3): : Ⅰ-SceⅠ RS和HMS174(DE3): : Ⅰ-SceⅠ RS。之后将λ-Red重组系统中的3种重组酶和来自酿酒酵母的归巢核酸内切酶(Ⅰ-SceⅠ) 结合起来，构建了质粒pAIO。该质粒主要含有3种重组蛋白(Exo、Bet、Gam)、Ⅰ-SceⅠ酶切位点(Ⅰ-SceⅠ restriction site, Ⅰ-SceⅠ RS)、编码Ⅰ-SceⅠ归巢核酸内切酶基因。Ⅰ-SceⅠ基因由阿拉伯糖启动子araB调控，由此在重组过程中，加入阿拉伯糖可诱导Ⅰ-SceⅠ归巢核酸内切酶表达，在基因组整合成功的菌株中，该酶可酶切质粒pAIO中的Ⅰ-SceⅠ RS，从而使质粒由环型变为线型，失去活性；而在未发生重组的菌株中，该酶可同时酶切基因组和质粒pAIO中的Ⅰ-SceⅠ RS，从而将未发生重组的细胞杀死，使其无法生长，同时将质粒由环型变为线型，由此完成阳性菌株的筛选过程。虽然阳性率未达到100%，但与λ-Red-FRT-FLP方法相比，减少了pCP20转化及抗性基因消除的过程，节省了时间。而且基因组上无多余的残留位点。

不论是最初的Red重组与位点特异性重组直接相结合的基因编辑策略，还是后来将Red重组系统与Ⅰ-SceⅠ归巢内切酶结合以达到无痕敲除的基因编辑策略，都在大肠杆菌基因整合中得到了应用并取得了很好的效果。表 1列举了近几年内运用复合基因编辑技术将不同的代谢途径整合至原核生物(主要是大肠杆菌) 基因组并高效表达目的产物的研究成果。

CRISPR/Cas9存在于细菌的免疫系统中，是细菌和古菌抵抗病毒的自我保护机制。CRISPR序列在1987年被首次发现，而该序列的抗病毒功能则是在2007年被首次证明。2012年，法国微生物学家Emmanuelle Charpentier和美国生物化学家Jennifer A. Doudna对CRISPR/Cas9靶向切割DNA分子机制进行了精细解析，创建了最方便快捷的CRISPR/Cas9基因组编辑技术，并于2020年荣获“诺贝尔化学奖”[57]。该系统包括成簇的有规律的间隔短回文重复(clustered regularly-interspaced short palindromic repeats, CRISPR) 和cas基因(CRISPR-associated, Cas)。cas基因编码Cas蛋白，该蛋白具有解旋酶活性和核酸酶活性，可以将DNA链解旋并切割DNA链。Cas蛋白上具有两个核酸酶结构域，分别结合crRNA (结合到Cas9蛋白上) 和tracrRNA (将crRNA固定在正确位置)，二者组合形成切割DNA复合体。Doudna JA和Charpentier E团队[58]根据结构生物学信息对该三组分进行了简化，他们将crRNA和tracrRNA相连接，形成一条单链向导RNA (single guide RNA, sgRNA)，这样便得到一个更简单的基因编辑系统。经过简化之后的CRISPR/Cas9系统被越来越多的研究者用于原核生物的基因组编辑中。

CRISPR/Cas9系统最早由Jiang等[59]开发用于细菌基因组编辑，是微生物基因组编辑的重大突破，但在大肠杆菌中并没有实现较高的编辑效率。另外，CRISPR/Cas9系统需要依赖于原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，但是较短的PAM序列在基因组中出现的频率高，因此很有可能在目的序列附近会存在一段与之相似的序列[60]，而且Cas9蛋白对PAM的容忍度高[61]，导致其可能和该序列结合从而引起预期之外的基因编辑，即所谓的“脱靶效应”。有研究指出可以通过选择独特的靶序列，并优化sgRNA和Cas9来避免或减少脱靶突变的发生[62]。限制其在微生物中应用的另外一个原因是修复方式。一般情况下，微生物体内，如大肠杆菌中存在自我修复的一种方式，即同源修复(homology-directed repair, HDR)，这是一种比较可靠的修复方式。而CRISPR/Cas9剪切基因组后，由于没有同源序列模板的存在，细胞会通过非同源末端连接(nonhomologous end-joining, NHEJ) 来完成基因组修复，这种连接方式由于随机性强，所以准确率比较低[63-64]。

近年来，CRISPR/Cas9系统和λ-Red系统的结合使用备受研究者们的欢迎，两种系统的结合使用不仅可以解除Red系统在同源重组过程中存在重组效率受目的片段大小的限制的问题，极大地提高基因编辑效率和基因编辑的准确率，还可以明显地减少CRISPR/Cas9系统本身存在的脱靶效应[20, 65-68]。这两种系统结合后，在sgRNA的引导下，具有核酸水解酶活性的Cas9蛋白和Exo蛋白可以定向剪切DNA链，一是剪切受体菌的染色体DNA片段，二是剪切含有供体DNA的质粒，从而得到线性的供体DNA片段，而Gam蛋白可以保护线性DNA片段，防止其被宿主本身存在的核酸内切酶水解，从而配合Bet蛋白完成整个重组和修复过程，最终完成整个基因编辑过程[65] (图 4)。在两种系统的结合使用下，为了减少脱靶效应，获得更精确的编辑效果，Cas9蛋白和3种重组蛋白(Gam、Beta和Exo) 往往需要诱导型启动子的调控，以便通过诱导剂的添加来严格控制基因的表达水平，从而更精准地完成基因编辑过程。

2015年，Pyne等[69]首次结合CRISPR/Cas9和λ-Red系统对大肠杆菌基因组进行了基因编辑。他们开发了一种三质粒策略，分别表达λ-Red功能(Exo、Beta和Gam (pKD46))、Cas9蛋白和相关的tracrRNA (pCas9) 以及可编程crRNA (pCRISPR)。他们利用该方法在大肠杆菌中完成了高达19.4 kb的DNA片段的缺失，以及3 kb的异源DNA片段的插入，而且没有疤痕位点的残留(如FRT疤痕位点)。2016年，Zhao等[68]在此基础上进一步简化，开发了一种简单、快速、高效的细菌基因组编辑方法；具体方法为：将sgRNA、cas9基因、Red重组酶基因构建至一个质粒载体上，仅通过一次转化便可完成基因编辑过程。在对未去除PAM序列的细胞进行基因编辑过程中，sgRNA会引导Cas9靶向细胞基因组中的PAM序列使之发生裂解，从而使细菌死亡[70]，所以在基因组编辑过程中对Cas9或gRNA的调控表达很重要。Zhao等[68]选择可被l-阿拉伯糖诱导的pBAD启动子来调控Cas9的表达，并在大肠杆菌中完成了基因片段的敲除和短基因片段的替换，编辑效率可达100% (同源臂为297 bp和298 bp)。但是该研究仍存在一些不足，基因编辑效率会随着同源臂的缩短而降低：当上下游同源臂减少至101 bp后，编辑效率仅有69.3%左右，而减少至51 bp后，编辑效率为0%[68]。2017年，Zhao等[66]对单质粒的基因调控进行了优化。在新构建的质粒pCAGO中，cas9由araB启动子负责调控，3种重组蛋白由trc启动子负责调控，而gRNA由组成型启动子负责调控。另外，他们筛选出了最佳靶向效率的通用N20序列，将l-同源臂、marker、N20PAM、l_short-同源臂、insertion、R-同源臂6个部分构建为基因编辑模块。之后将该基因模块和质粒pCAGO转入大肠杆菌，在3种重组蛋白的作用下，基因编辑模块通过同源重组整合到大肠杆菌基因组中，之后，CRISPR/Cas9系统会促使双链在N20PAM序列处发生双链断裂(double-strand break, DSB)，接着，在l-同源臂和l_short-同源臂之间发生同源重组，将marker消除，由此完成无痕基因组编辑过程。该技术有效地解决了常规CRISPR/Cas9方法的序列限制，并显著降低了脱靶频率。此外，可以将l_short-同源臂设计为与l-同源臂的上游区域互补序列，由此可完成长片段的基因簇敲除。该研究完成了10–100 kb的基因簇敲除，其中10–30 kb的编辑效率为100%，70–100 kb的编辑效率为75%。2020年，Huang等[20]将CRISPR/Cas9系统和λ-Red系统构建于双质粒系统，实现了12 kb的DNA片段的插入和186.7 kb的DNA片段的删除。12 kb的DNA片段插入的基因编辑效率和阳性率分别达到了7.2×10–4和98.3%。删除186.7 kb的DNA片段的基因编辑效率和阳性率分别为(1.20±0.09)×10–3和(97.7%±2.6%)。他们又利用该方法将异丁醇合成途径整合到大肠杆菌MG1665基因组后，得到了遗传稳定的菌株，且异丁醇的产量达到了1.3 g/L。

除此之外，CRISPR/Cas9系统还可以同时对多位点进行编辑。Feng等[71]开发了CRISPR/Cas9辅助多基因组编辑(CRISPR/Cas9 assisted multiplex genome editing, CMGE) 技术，可以同时对大肠杆菌的4个位点进行编辑。

CRISPR/Cas9系统除了通过参与双链断裂，在双链修复过程中完成基因编辑外，还可通过对Cas9改造进行基因编辑。部分研究者通过使Cas9蛋白的单个或两个切割结构域失活，并融合可以与突变特异碱基的脱氨酶进行融合，从而使胞苷突变为胸苷，完成精确的基因编辑，该系统被命名为“base editor” (缩写为BE)[72]。来自哈佛大学的David R. Liu课题组创建了新型的腺嘌呤碱基编辑器(adenine bases editors, ABEs)，该编辑器可将细菌和人类细胞基因组DNA中的A·T转换为G·C碱基对[73]。ABE与之前的BE一起，极大地扩展了碱基编辑的范围，使基因组DNA四种碱基间的相互转换成为可能。华中农业大学的刘正飞教授课题组在此基础上创建了CRISPR/Cas9指导的BE3系统，该系统可诱导C替换为T，将该系统分别应用于大肠杆菌和布鲁氏菌，分别完成了rppH基因和virB10基因中的Gln密码子(CAA) 到终止密码子(TAA) 的突变，编辑效率均达到了99%以上[74]。

随着分子生物学的快速发展，各种基因编辑技术，尤其是两种或三种基因编辑技术的结合使用让原核生物的基因组编辑有了很大的进步，不仅可以在大肠杆菌中实现单基因的敲除与敲入，还可以完成基因簇的敲除与敲入，同时也使长片段的产物代谢途径敲入基因组成为可能。比如在糖蛋白生产上，已有研究者将糖基化修饰旁路途径整合至大肠杆菌基因组上，改造后的大肠杆菌表现出更高的生长密度，糖基化效率也有一定的提高[54]。

基因表达水平主要依赖于转录和翻译后修饰调节元件，如启动子(promoter)、核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)、信号肽(signal peptide) 等，其中启动子作为基因转录的“开关”，在调节基因表达水平和重构代谢通量方面起着重要作用。在将外源代谢途径整合入基因组后，由于变为单拷贝，所以基因表达量可能会有所下降，这时需要更换强度适宜的启动子来调节基因表达从而得到符合预期的表达量。在Red重组过程中，由于有FRT位点的残留，给下一步的基因编辑增加了很多不确定性。为了避免在替换启动子过程中将代谢途径敲除的可能，我们提出了新的编辑策略，即将含FRT位点的抗性筛选片段克隆在代谢途径的上游，这样可以很方便地替换不同的调控元件，同时不会干扰敲入的代谢途径相关基因(图 5)。

通过基因组编辑将代谢途径整合至大肠杆菌基因组可以获得相应的可生产目标产物的遗传稳定性菌株，同时可以避免由质粒系统给菌株带来的代谢负担以及抗生素的滥用，这在工业生产上具有很大的应用价值。希望在不久的将来可以根据生产需要来定制相应的工程菌株，从而为其大规模生产目标产物奠定基础。