dNTP使用浓度：在PCR反应中，使用低dNTP浓度，可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。在常见的PCR应用中，各种dNTP的常用终浓度通常为0.2 mM。一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。例如在100 μl的反应体系中，4种dNTP的浓度为20 μmol/L，可基本满足合成2.6 μg DNA或10 pmol/L的400bp序列。使用低dNTP浓度(每种dNTP浓度为2 μmol/L)，能够高度灵敏地(1/107)扩增ras基因点突变的等位基因。

有时，使用高浓度dNTP也可能也是有益的，特别是在存在高浓度 Mg2+的情况下，因为Mg2+可与dNTP结合，减少可被引入的dNTP量。但同时，当dNTP超过最佳浓度时，会抑制PCR反应。为使DNA聚合酶完成有效扩增，反应中的游离dNTP浓度不得超过 0.010–0.015 mM（其估计 Km值）。当使用非校正DNA聚合酶时，可通过降低dNTP浓度（0.01–0.05 mM）和成比例减少 Mg2+来提高保真度。

3.TaqDNA聚合酶：

DNA聚合酶是PCR的重要组成部分，它们能够从单链DNA模板合成新的互补链。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即掺入核苷酸并使引物从按5'至3’方向延伸。

图1：DNA聚合酶沿5′至3′方向使PCR引物延伸。

早期的PCR，通常使用来源于大肠杆菌的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 来生成新的子链。但是，这种大肠杆菌酶对热敏感，易受到变性阶段高温度的破坏，从而无法继续进行退火和延伸步骤。因此，需要在全程每个循环的退火步骤中重新补充酶。

热稳定DNA聚合酶的发现是一项重大进步。它实现了长时间的反应稳定性，为PCR方法的改进提供了无限可能。1976年，从耐热菌Thermus aquaticus中分离出来的TaqDNA 聚合酶是最有名的热稳定DNA聚合酶之一。1988年研究人员首次报道，证明 TaqDNA 聚合酶能够在 75℃以上保持活性，从而无需手动加入新鲜的酶即可持续循环扩增，实现了工作流程自动化。此外，与大肠杆菌 DNA聚合酶相比，TaqDNA 聚合酶能够获得更长的PCR扩增子，并且具有更高的灵敏度、特异性和得率。也因此，TaqDNA 聚合酶被《科学》杂志评为1989年的“年度分子”。

尽管 TaqDNA聚合酶大大改善了PCR实验方法，但也表现出一些缺点。例如，TaqDNA 聚合酶在90℃以上的DNA链变性温度中相对不稳定。对于需要更高解离温度的富含GC和/或具有强二级结构的DNA模板而言，这一问题尤为明显。同时，TaqDNA 酶还缺乏校正活性，会在扩增期间引入错误核苷酸。对于克隆和测序而言，序列的准确性至关重要，所以不能存在含有错配的PCR扩增子。此外，TaqDNA 聚合酶的易错配特性使其通常无法稳定扩增长度大于5 kb的片段。为克服这些缺点，性能更好的DNA聚合酶不断被开发出来，使PCR在广泛的生物学应用中发挥其强大的功能。

目前有两种TaqDNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化--典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100 ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

4.引物：

PCR引物是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合（通过序列互补）。在PCR反应期间，DNA聚合酶从 3′端开始延伸引物。因此，引物结合位点必须是靶标附近所特有的，并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以确保目的片段的特异性扩增。

除了序列同源性，引物还必须考虑到其它相关问题，，以确保PCR扩增的特异性。首先，引物序列的熔解温度（Tm）必须在 55–70℃之间，两种引物的 Tm相差不超过 5℃。同样重要的是，引物的序列不能具有互补性（特别是3’末端），若两个引物互补会促进退火（即，引物二聚体），自我互补会导致自我配对（即，二级结构），或序列的直接重复会导致与模板目标区域产生不完全配对。引物的GC含量最好在40-60%之间，均匀的C和G分布能够避免错误发生。同样，为了尽量减少非特异性，引物3′端最多只能含有3个G或C碱基。另一方面，引物3′端含有1个C或G核苷酸有利于引物的锚定和延伸。

表1. PCR引物设计的一般建议

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。

长序列引物（如，>50 nt）或碱基经修饰的引物通常需要进行 纯化 ，以去除非全长产物和未结合的核苷酸。对于分子克隆和突变等应用，建议将引物进行纯化，序列和长度的完整性对于实验的成功至关重要。

为PCR克隆设计引物时，可在5'末端引入限制性酶切位点、重组序列和启动子结合位点等延伸的非模板序列。这些延伸序列需进行精心设计，以尽量减小对PCR扩增和下游实验应用的影响。

在配制PCR反应体系时，引物加入量应在0.1–1μM范围内。对于含有简并碱基或用于长片段PCR扩增的引物，常用的引物浓度为0.3–1μM 。通常，建议先使用标准浓度，然后根据需要再进行调整。引物浓度过高容易产生错配和非特异性扩增。而引物浓度过低可能会导致目的片段的少量扩增或无扩增。

5.镁离子（Mg2+）：

镁离子（Mg2+）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外，Mg2+能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物。

图2：DNA聚合酶活性位点处镁离子的作用。在DNA聚合期间，Mg2+可帮助协调引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间发生相互作用。

通常情况下，Mg2+以MgCl2的形式提供。但是，因硫酸盐在某些情况下有助于确保更稳定和可重现的性能，诸如 PfuDNA聚合酶等一些聚合酶首选MgSO4。由于镁离子能够与dNTP、引物、DNA模板和EDTA（如果存在）结合，因此，通常需要对镁离子浓度进行优化，以尽量提高PCR得率，并保持其扩增特异性。

在PCR中，标准的 Mg2+终浓度范围为1–4 mM，建议优化滴定增量为0.5 mM。Mg2+浓度过低会降低TaqDNA聚合酶活性，导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面，Mg2+浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性，反应特异性降低，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入导致的复制错误。

6.缓冲液：

用于维持DNA聚合酶的活性和稳定性。缓冲液pH通常为8.0-9.5，一般使用Tris-HCl来调节。

对于 TaqDNA 聚合酶，缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子（K+)，其可促进引物的吸附。有时，也可使用硫酸铵(NH4)2SO4代替KCl。铵离子(NH4+) 具有去稳定作用，尤其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键，因此可增强反应特异性。

图3：缓冲液离子对DNA双链形成的影响。钾离子和镁离子 (K+和 Mg2+) 能够与DNA骨架上的磷酸基团 (P–) 结合并稳定双链形成，而铵离子 (NH4+) 能够与碱基（N）之间的氢键相互作用并破坏双链形成。

由于 Mg2+与K+具有相似的稳定效应，因此，当使用KCl缓冲液时，MgCl2的建议浓度通常较低(1.5 ± 0.25 mM) ，当使用(NH4)2SO4缓冲液时，MgCl2的建议浓度通常较高 (2.0 ± 0.5 mM)。由于NH4+与Mg2+具有拮抗效应，因此，在各种 Mg2+浓度下，含有(NH4)2SO4的缓冲液都表现出更高的引物特异性。由于最佳的PCR缓冲液取决于所使用的DNA聚合酶类型，所以有必要遵循酶供应商的提供的缓冲液建议。

在某些情况下，可在缓冲液中加入化学添加剂或辅助溶剂，通过减少错配来提高扩增特异性，并通过去除二级结构来提高扩增效率。此外，一些DNA聚合酶还随附提供了专为DNA聚合酶和PCR缓冲液优化的特殊增强剂。这些试剂常用于困难样品，如富含GC的模板。应注意，使用化学添加剂或辅助溶剂会影响引物退火、模板变性、 Mg2+结合以及酶活性。同时，它们还会干扰某些下游应用——例如，基因芯片实验中的非离子去污剂。因此，为了成功进行PCR扩增和下游实验应用，应慎重考虑缓冲液组成成分。

表2. 用作PCR增强剂的常见添加剂或辅助溶剂，以及其建议终浓度

7.热循环仪:

热循环仪是一种能够为PCR反应自动完成温度循环和孵育的仪器。在引入热循环仪之前，PCR反应是一个费时费力的过程，需在不同温度的水浴之间转移样品，并为每个步骤需要精确定时。热循环仪和 TaqDNA 聚合酶的发现，让PCR的自动化成为现实。第一款自动化PCR热循环仪是在1985年由PerkinElmer和Cetus以合资方式引入市场的。

二、PCR反应条件

1.变性温度与时间

模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性，一般情况下可设为94℃ 20-30秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热DNA聚合酶的活力，最高变性温度不宜超过95℃。

2.退火温度与实践

退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45-68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为30-60秒，足以使引物与模板之间结合，没有必要长时间退火。

3.延伸温度与时间

PCR反应的延伸温度一般选择在70-75℃之间，延伸时间根据所有聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定。如同样扩增2kb片段，若使用Taq酶只需要1分钟，使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。

4.循环次数

可根据模板DNA的量，扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定30-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

END

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