该技术通过在反应体系中加入饱和DNA双链荧光染料，PCR反应结束后进行DNA双链产物升温解链反应获取荧光信号。随着温度的升高，DNA双链氢键逐渐打开，荧光染料释放，荧光强度逐渐降低。不同核酸片段有特征性的温度-荧光强度变化曲线(即熔解曲线)。只有单一碱基的改变也能通过熔解曲线不同(主要表现为形状不同和熔解温度不同)表现出来。即使对于第四类单核苷酸变异(single nucleotide variations, SNVs)，依据“相邻碱基”理论(nearest-neighbor theory)预测其熔解温度差值(ΔTm)为0.0℃，应用高分辨熔解曲线分析方法仍能将其区分开[4-6]。

高分辨熔解曲线分析技术主要依赖于含有饱和DNA双链荧光染料、目的片段设计优化了的PCR靶标片段，能够有效控温获取高分辨熔解曲线信号的仪器系统和熔解曲线软件分析系统。

2.1 含饱和DNA双链荧光染料的特异PCR靶标片段获取

DNA双链荧光染料有很多，但饱和DNA双链荧光染料，是实现高分辨熔解曲线分析检测的基础。Real-time qPCR常用的SYBGreen是不饱和双链DNA染料，可以通过粗略的熔解曲线分析判断PCR产物的特异性，但无法精确实现基因分型和变异检测[7]。饱和双链染料能最大限度与PCR产物结合而不抑制PCR反应，稳定表现出目的片段对应的熔解曲线特征[3]。目前商品化的饱和双链染料有多种，如LCGreenⓇ plus(Idaho technology)、SYTOⓇ 9(Invitrogen)、EvaGreenⓇ (Biotium)等[8]。另外，依据待检测基因序列构成、变异位点、变异类型等不同，设计合适长度和GC含量的PCR产物也是必要的。一般来说，目的片段越短，越有利于变异位点检出，但有些基因片段当长度适当增加，或增加为多个熔解结构域(melting domain)时更有利于基因分型和变异检出[4, 9]。在目的基因片段熔解曲线分析前，可以通过熔解曲线预测软件预测熔解曲线形状和Tm值(多少个熔解结构域及大致的温度范围等)设计优化目的片段[10-12]。

2.2 高分辨熔解曲线分析仪器

所有real-time PCR仪都具有升降温控制系统和荧光信号采集的功能，但并不是都能用于高分辨熔解曲线分析。现在商业销售的大多real-time PCR仪都添加了专门的HRM模块和通道进行熔解曲线分析，但仪器设计原理、构造各不相同，以致检测时间、检测通量、检测准确性、敏感性、特异性等方面都存在差别(表 1、图 1)[13-14]。高分辨熔解曲线分析是依靠区分熔解曲线之间的差异发现目的基因变异。基因序列、基因片段长度、基因变异类型(插入/缺失突变、点突变、多碱基点突变之间)都会影响熔解曲线的变化，进而影响变异型与野生型熔解曲线间的区分。目的片段长度增加常导致熔解曲线差异的缩小；有些基因变异类型，如三类(C/G)和四类(T/A)SNVs，熔解曲线变化也很小(Tm值变化＜0.4℃)，即使其他条件足够优化，熔解曲线间的误差也可增加基因变异检出的假阳性或假阴性率[15]。因此仪器控温的精确度直接影响熔解曲线分析结果。通常认为空气控温和单样品上样模式仪器的控温效果好于加样板上样模式为基础的仪器，另外单一样品序贯检测或单一样品光纤检测的仪器要优于全加样板一起检测的仪器[13-14, 16-17]。

4种目的片段长度具有同一SNV位点纯合子基因分型准确率在10种HRM仪器平台检测结果比较

2.3 高分辨熔解曲线数据分析

高分辨熔解曲线法检测获得的原始数据是一系列荧光强度对温度的数据点，将这些原始数据点进行数学转换，生成原始平滑曲线是数据分析的基础。分析数据之前，需要观察原始曲线，如果出现了非特异性产物的熔解曲线或是PCR产物量过少(熔解前后荧光强度变化很小)时，会影响目的片段基因分型或基因变异判别的结果，均不应进行下一步的分析。高分辨熔解曲线检测需要优化PCR反应，避免非特异性扩增，并保证产物量充足。一般高分辨熔解曲线数据分析主要包括：荧光背景(噪声)去除，曲线标准化(Normalization)；空间位置差异校正(curve overlay或temperature shifting)；一阶负导数曲线生成(negative first derivative curve)和差异曲线生成(difference curves)等[3, 18]。HRM仪器一般都自带软件分析系统，但一些商业软件设计存在固有缺陷，如没有背景噪声去除，没有负导数曲线分析等，限制了数据有效分析。作者在前期比较1600多例第四类SNV纯合子基因分型样品准确率时发现，应用Bob Palais教授等开发的专门针对HRM分析的MW软件分析准确率显著高于商业软件分析结果[14]。

分子诊断临床主要应用于体细胞基因分型，包括针对SNV位点杂合子、纯合子及纯合子类型区分的遗传疾病相关检测，药物代谢相关基因多态分析筛选治疗药物等；稀有等位基因变异检测，包括单核苷酸变异，插入/缺失突变，拷贝数变异，结构变异如融合基因等的恶性肿瘤相关分子靶向药物筛选，耐药性及预后判断分析等；以及病原体检测，如病原体特异基因片段的快速筛查检测等。

3.1 基因分型分析

基因分型分析所用的样品常为外周血或颊粘膜等来源的体细胞，样本差异较小，基因检测相对简单。对于杂合型和第一、二类纯和型SNVs，应用高分辨熔解曲线分析敏感性和特异性均近100%，HRM检测平台间差异不大，但对第三、四类呈“相邻碱基对称结构”的SNVs(大约占人类SNVs的16%)，需要通过调整目的片段长度、改变熔解曲线获取条件、加入外源短片段双链DNA和定量计算分析等方法提高该类难区分纯和型的敏感性和准确性[4, 18-19]。

3.2 基因突变扫描(gene mutation scanning)分析

基因突变扫描多用于对肿瘤细胞的检测，而获取待检测肿瘤细胞标本时，无论标本来源于组织、血液还是胸腹水、脑脊液标本，都不可避免的混有大量正常组织细胞，而且瘤细胞比例常常不能明确，从而增加了基因突变检测的难度。对于传统认为靶基因检测“金标准”的Sanger测序法，因其检测敏感性只有20%~30%，即目标片段发生基因突变的比例至少高于20%~30%时，应用Sanger测序法才能检出，而高分辨熔解曲线分析方法灵敏度对于一般单核苷酸突变检测可达1%[9, 20-21]。对于上述难检测的SNVs除了应用基因分型时提及的方法外，还可以应用专门针对稀有等位基因富集的无标记探针(unlabeled probe)和回弹探针(snapback primer)的高分辨熔解曲线分析方法检测，进一步提高检测灵敏度[22-23]。常规基因突变检测方法对插入/缺失突变检测是难点，而这正好是高分辨熔解曲线法的优势，片段变化大更容易从熔解曲线形状上反映出来[5]。

拷贝数变异(copy number variation, CNV)与药物敏感及耐药的相关性逐渐得到证实，但传统基因检测方法难以进行拷贝数变异检测。2015年，Dr. Zhou等[24]通过限制dNTP浓度的二重或三重PCR限制扩增产物不均衡，成功实现了基于高分辨熔解曲线技术的拷贝数变异检测方法，并应用于脊髓肌肉萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)相关基因SMN1、CLTCL1、KLHL22、PI4KA拷贝数变异的检测[25]。

酪氨酸激酶相关融合基因(gene fusion)形成引起该酶的自身激活是肿瘤发生的重要原因，该融合基因也成为药物作用靶点，检测融合基因对临床化疗药物选择具有重要意义，但融合基因变化多，结构复杂，难于检测。作者前期发明了基于高分辨熔解曲线分析技术的ALK融合基因的检测方法，以接头多重PCR法扩增，实现了一个反应管内至少20种ALK融合基因的检测并分型(图 2)。并且引入二阶导数曲线分析方法获取关键参数，应用二次辨别分析(quadratic discriminant analysis)实现结果判读的自动化[26]。至此，高分辨熔解曲线分析技术成为可以覆盖单核苷酸变异、插入/缺失突变、拷贝数变异、融合基因全部基因变异类型的基因检测技术。

3.3 病原菌筛查

高分辨熔解曲线分析方法污染风险低、检测速度快，受到病原菌检测与筛查的青睐。依据病原菌特定基因片段对应特征熔解曲线可以进行单一病原菌检测，多病原菌同时检测和分型[27]。美国临床广泛应用的多病原菌快速筛查仪器FilmArray病原菌鉴定原理也是通过高分辨熔解曲线方法。

同任何方法一样，高分辨熔解曲线分析技术也具有一定局限性，如检测基因变异不能像测序技术结果那样给出具体变异位点和变异类型，因此难以辨别未知突变位点，另外检测灵敏度受检测基因片段SNVs类型影响，给检测实验设计带来一定难度。但是该技术具有的优势恰好契合了现在个体靶向治疗分子诊断的需求。该技术不但同其他以目的基因片段为检测目标的基因检测方法一样，具有灵活、快速、灵敏度高、成本低等优点，还可实现全部基因变异类型的检测，而且可以灵活地增加检测通量，节约检测样品量、检测时间和成本、降低污染风险以满足临床检测需求。

随着PCR技术由1~2 h的普通PCR(40个循环)，到15~30 min完成的快速PCR(rapid PCR)，到从采血提取DNA到PCR扩增完成不到1 min的极速PCR(extreme PCR)，高分辨熔解曲线分析技术检测速度也不断加快，升温速度可达8~16℃/s，成为快速熔解曲线分析技术(high speed melting analysis)[4, 7, 29-30]。最新报道以极速PCR结合快速熔解曲线分析进行乙肝病毒和难辨梭菌分型检测中，从扩增到出检测结果只需52~87 s[31]。

综上，高分辨熔解曲线分析技术理论上在临床分子诊断中具有巨大开发潜能和应用价值，但在具体实践中如何依据需求灵活地量身定制快速、灵敏的检测方案还有很多具体问题有待解决，如有效扩展通量方法、多重结果判读数字化实施等。

参考文献

李梅. 高分辨熔解曲线分析技术在分子诊断中的应用[J]. 大连医科大学学报, 2019, 41(6): 481-486. 返回搜狐，查看更多