本文叙述了 PCR工艺的详细操作流程，着重介绍了试验过程中的注意事项，列出了常用缓冲液配方。在了解实验的基础上，使操作更加顺畅。

聚合酶的链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种体外合成双链 DNA的方法，其原理类似于自然 DNA的复制过程，其特异性主要取决于特异引物和与其目的片段两端互补的高特异性酶(热启动酶)。经典的 PCR反应分为变性、退火、延展三步，通过多次循环反应得到目的片段。

I试剂制备

一、 DNA模板

2.特定引物

3.dNTP Mix

4.PCR buffer

五、热启动酶

第二步：行动

1.构建反应系统

在0.5 ml的离心管内依次加入各组分

采用热启动酶进行扩增，使其在常温下运行，非热启动酶在低温配置反应体系。

根据试剂盒说明书设定反应时间和温度，扩增结束后进行电泳鉴定

三、琼脂糖核酸电泳

把电泳所用的器皿蒸馏水清洗干净，把梳子固定好

以待分离 DNA片段的大小为基础，制备适当浓度的琼脂糖凝胶，精确称取一定数量的琼脂糖，加入锥形瓶，并加入约30 ml电泳缓冲液(TAE)

用微波炉加热熔化，冷却至40℃左右，充分混合后倒入电泳槽

在室温下进行40分钟的凝固，小心地拔出梳子，将凝胶放入电泳槽准备点样

向电泳槽内加入电泳缓冲液，漫过胶体表面即可，点样孔内无气泡

点样前准备好，(在八连管中)加入5 ul样品，把1 ul的6 xLoding buffer和1 ul的染料混合，用抢把混合的样品缓慢地注入点样孔，注意不能有串孔

::按正负极(红，黑，黑)接通电源，电压40-60 V，时间30-40 min，根据溴酚蓝的位置可判断电泳是否终止

结束电泳，关闭电源，观察凝胶成像，通过 marker对比确定碎片的大小

3.注意事项

引子

引物是 PCR反应成功与否的关键，为了保证扩增的准确性和效率，引物设计应遵循以下原则：

一、引物设计：在 NCBI上搜索不同物种的相同基因，通过序列分析软件得到相同基因的序列，即为该基因的保守区。

二、引物长度：15-28 bp，大于38 bp时，退火温度升高，不利于普通 Taq酶扩增

3.引物中 GC的含量为40%-60%, Tm最接近72℃

四、由于密码子的简并性，引物的3’端最好避开密码子的第三位(最好是 T)

五、碱基分布不均匀，3’端不超过3 G或 C

6.引物本身不形成发夹结构，引物设计完整，要通过 BLAST验证

PCR扩增对模板要求不高，可以采用单链或双链 DNA作为扩增片段，但 PCR可以扩增少量的 DNA，为保证扩增的专一性，对不同来源的模板，起始浓度有一定要求，如下：

模版可以是纯化过的样品，也可以是粗制滥造的样品，不同来源的模版采用不同的处理方法，试验模版纯化越简单越好，但模版中若有 Taq酶抑制剂，蛋白酶，核酸酶等，会干扰反应。取模时要注意保存，不要放置过久，避免反复冻融，防止降解。大多数人都会忽略这个问题，当实验结果不带条纹时，可以优先考虑是否是模板降解的原因。

实例：细菌 DNA提取法

取1-2 ml菌液，离心12,000 rpm 10 min，除去上清，得到沉淀

2.根据得到的沉淀量，加入约500 ul的 TE (以下是配方)悬浮沉淀，并加入20 ul溶菌酶，30 min 37度保温

3.加入10%的30 ul的 SDS和1 mg蛋白酶 K，混合后1 h 37度保温

5 mol/l氯化钠的添加量为120 ul，完全混合，65度置10 min

5.等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)充分混合后，12000 rpm离心5 min，在干净的 EP管中得到上清

6.等体积氯仿：异戊醇(24:1)充分混合，12,000 rpm离心5 min，得到上清于速凝胶管

7.加入等体积的异戊醇，充分混合，-20℃置入30 min,10000 rpm，离心5 min

8.除去上清液，得到 DNA沉淀用70%乙醇漂洗(动作轻柔，不产生沉淀)，吸干，通常可得到3-5 ug DNA

其他

1. Taq DNA聚合酶： Taq酶有多种