实验步骤

1. sgRNA的设计：（1）sgRNA的设计原则：       1）sgRNA的长度：S. pyogenes II型CRISPR系统（SpCas 9）一般为20nt。

2）sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列为位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)，所以选择3'末端含有GG的sgRNA，这样可以构成PAM序列。同时，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为30%-70%（40%-60%）。

3）sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高，一般大于60，认为是可用的。

4）如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。

5）全基因的脱靶效应分析，需要考虑脱靶位点的错配碱基数，最多不超过5个。        6）如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上。（2）sgRNA的设计步骤

通过网址：https://www.deskgen.com/landing/cloud进行sgRNA的设计，进入网址后点击KNOCK OUT进入设计页面，输入想要设计sgRNA的名称后，进行sgRNA的选择。由于内含子在基因表达的过程中，不会进行表达且会被删掉，所以我们在设计sgRNA时一般在靠近启动子的第一个CDS区（也就是外显子的保守结构域）进行sgRNA的选择。在网站上，On-Target和Off-target都是有评分的，一般来说，评分越高，则sgRNA越好。On-Target其实就是sgRNA对目标位点识别后与DNA模板进行识别切割的的效率，所以准确性越高，On-Target的评分越高。Off-Target也就是脱靶效应，由于CRISPR技术的切割是由sgRNA根据PAM序列定位识别位点，从而进行切割，但是如果sgRNA识别的位点是错误的，就产生了错误切割，这样就产生了脱靶效应。所以说，在进行sgRNA选择的时候，要尽可能地选择脱靶效率比较低的，也就是Off-target分值比较高的。另外，符合sgRNA的其它设计原则就可以了。

1. 反应体系：

Mix

12.5 μL

R 

0.75 μL （10pmol/ μL） 5-7.5 pmol

F 

0.75 μL （10pmol/ μL） 5-7.5 pmol

模板

1000 bp，Buffer NE或ddH2O需要加热到70℃后，再进行洗脱。）

连接反应

1. T4 DNA ligase连接反应体系：

T4 DNA ligase

1  μL

Insert Gene

 μL （