发布时间： 2019-03-02

                                PCR实验技术 

PCR（聚合酶链式反应） 

【原理】 PCR（polymerase chain reaction）用于在体外将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。反应体系：①样品DNA；②引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约15-20个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区之间的区域；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，是从一种嗜热水生菌（Thermus aquaticus）中分离出来的。此酶zui适作用温度为75～80℃，但短时间在95℃下不失活。⑤适宜的缓冲体系和适量的Mg2+。反应过程：①变性：将反应液置于PCR仪中，提高温度（约90-95℃）使DNA双链解离；②复性：降温（约60℃左右）退火，使引物与模板结合；③延伸：升温度至70-75℃，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成DNA双链片段；④重复上述“变性——复性——延伸”的过程。zui初几次循环中形成的长链DNA较多，但随着反应的进行，长链DNA以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目标DNA以指数级数增长，经大约20—30次循环后，扩增产物中主要是目标DNA。 

【材料】 1. 试剂和溶液  （1）10 × PCR缓冲液 500 mM 氯化钾 100 mM Tris-Cl （室温时pH 8.3） 15 mM 氯化镁 （2）10 mM脱氧三磷酸核苷（dNTPs） 溶液－含有所有四种dNTPs（pH 8.0） （3）耐热的DNA 聚合酶： ① Taq DNA 聚合酶是从表达克隆嗜热水生菌的DNA 聚合酶基因的大肠杆菌提纯而来。此酶有5’→3’ DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’ 外切酶活性。此酶由分子量约为94 千道尔顿的多肽组成。Taq DNA聚合酶对热稳定，能在较高的温度下利用引物将单链模板合成为DNA。 催化一典型的PCR所需酶量约为2单位。加酶量过多则有可能导致非靶序列的扩增。 Taq DNA 聚合酶缺乏校正功能，在PCR过程中核苷酸掺入错误率可达每循环2 × 10-4个核苷酸，约比使用大肠杆菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段时高4倍。对于一个30轮循环的扩增反应来说，这一掺入错误率将导致0.25％的总错误频率。这一频率似随和浓度的升高而增大。这些错误的掺入可以发生在扩增产物的任何位置，既有颠换也有转换（但并无长的缺失、嵌合或插入）。 单位的定义：一单位是指于74ºC将l0 nmol的脱氧核糖核苷酸30分钟内掺入到酸性沉淀的物质中。其实验条件是：25 mM TAPS （pH9.3）, 50 mM 氯化钾, 2 mM 氯化镁, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml 有活性的鲑鱼精液DNA, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP。 ② rTth DNA聚合酶是Thermus thermophilus（Tth）和Thermococcus litoralis（Tli）两种菌中耐热DNA聚合酶的混合。这种混合酶特别具有5’→3’DNA 聚合酶和3’→5’外切酶（校正）的双重活性。当按推荐量使用时，此酶可提高保真度及长链PCR的产量。 常规PCR扩增靶DNA序列一般在5 kb以内。而rTth DNA 聚合酶可从人类基因组DNA中扩增至19.6 kb的β－球蛋白基因群和噬菌体λDNA的42 kb的片段。  （4）琼脂糖凝胶 （5）10 µM的上游和下游引物 （6）DNA模板 （7）对照DNA（含有靶序列的DNA） （8）DNA长度标准参照物 2. 设备 （1）0.2 ml PCR扩增管 （2）可预先设定扩增方案的温度循环器（PCR仪） 

【方法】 

方法一、基本的PCR方法 下面介绍的基本PCR方法可作为任何PCR扩增的一般指导和出发点。由于各种PCR反应条件（如PCR扩增次数、温度、Taq DNA聚合酶的浓度、引物、氯化镁以及模板DNA）变异极大，应根据具体情况，对各种PCR反应条件进行相应调整。 1．按以下次序，将各成分加入0.2 ml灭菌扩增管中： 成分                     体积                 终浓度 10 × PCR缓冲液                5 µl                    1 × 10 mM dNTP溶液（pH 8.0）         1 µl             每种0.2 mM 10 µM 上游引物                 2.5 µl                0.5 µM 10 µM 下游引物                 2.5 µl                0.5 µM 5单位/µl 耐热DNA聚合酶        0.5 µl              2.5单位 DNA模板                       1-10 µl             1 pg-1µg 消毒的蒸馏水                  至50 µl    * 我们主张，对于多管反应可配制混合液于一管中，然后分装至各管，以减少试剂损失和各管分别加样的不准确性。 2．将小管中的混合物混匀，并加入50 µl矿物油或硅化油覆盖小管中的混合物。 3．盖紧小管，短暂离心，以使PCR混合物沉于管底。 4．小管在温度循环器（PCR仪）中94ºC温育3分钟，以使模板DNA完全变性。 5. 按以下方法进行25-35个循环的PCR扩增： 变性        94ºC          30秒  退火        55ºC          30秒 延伸        72ºC       1分钟/1 kb 6．72ºC温育PCR样本10分钟，可于4ºC维持。样本可贮存于-20ºC直至使用。 7．采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物，溴化乙锭染色显影DNA，用合适分子量标准的DNA作参照。 方法二、热启动方法 热启动PCR的方法是在反应温度降至80ºC时添加Taq DNA聚合酶，以保证高特异性PCR产物的合成。 1．如基本的PCR方法所述，添加所有的PCR反应的混合物，但不加Taq DNA 聚合酶。 2．将小管中的混合物混匀，并加入50 µl矿物油或硅化油覆盖之。 3．盖紧小管，短暂离心，以便于PCR混合物沉于管底。 4．小管在PCR仪中94ºC温育3分钟，以使模板DNA完全变性。 5. 94ºC温育后，维持PCR反应在80ºC。 6．每一PCR反应管添加0.5 µl （2.5 U）的 Taq DNA 聚合酶，注意应保证酶加入到油下面的PCR混合物中。 7．按照基本的PCR方法所述，继续完成25-35个循环的变性、退火和延伸。 

【注意事项】 1. PCR引物设计： 引物设计可能是PCR扩增成功zui关键的因素。如引物设计欠佳，可能导致扩增产物不足，甚至扩增失败，其原因是设计欠佳的引物可导致非特异扩增和/或形成引物二聚体，此又成为PCR反应的竞争性产物，从而进一步抑制PCR产物形成。 在引物设计时必须考虑以下几个因素，其中zui重要的是引物长度、溶解温度（Tm）、特异性、引物序列互补问题、G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸、3’-末端序列等。  （1）引物长度：由于PCR反应的特异性、退火温度以及时间均至少部分与PCR引物长度相关联，因此引物长度是PCR扩增是否成功关键的因素。一般PCR引物长度为15-30核苷酸。 （2）溶解温度（Tm）：因加热而断开H键，使双链DNA分开或“溶解”为单链DNA。溶解温度（Tm）即指使一半双链DNA变为单链DNA的温度。Tm可采用下列公式计算：Tm＝2（A+T） + 4（G+C）。 需注意PCR反应至少有两个（一对）引物，两个寡核苷酸引物Tm 值应比较接近，不可差异过大。因有较高的Tm值的引物在较低的反应温度时可发生错配，而引物Tm值较低，反应温度较高时则可能不能发生作用，因此如引物的Tm值差异较大，可导致PCR扩增效率低下甚至扩增失败。 （3）引物序列互补：设计引物时应绝对没有3个碱基以上的内引物配对，如引物有这样具有自我配对的区域，“弹回”即部分双链结构将发生在退火反应时。 （4）G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸：待选择的引物序列应尽可能是碱基随意分布，G+C含量平均-避免长A+T和富含G+C的区域。在引物的碱基组成中GC含量一般为45％-55％。在选择的引物序列中应没有多G 或多C延伸，因其可促进非特异性退火，多A 和多T延伸也应避免，因其可“呼吸”和使引物－模板复合物展开延伸，降低扩增的效率。同时多嘧啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也应被避免。  （5）3’-末端序列：为控制引物错配，应认真地确定PCR引物中3’末端的位置。 总而言之，应重视PCR引物设计，设计PCR引物时应认真小心。对于一个成功的PCR来说，几个重要因素如引物长度、GC含量和3’序列必须优化。理想的引物应为差不多随意分布的核苷酸混合、GC含量50％、长度约为20个碱基，因此能使Tm值处于56-62ºC范围。分析靶基因潜在引物位点时，应考虑无单聚合体, 没有明显的二级结构形成的倾向，不自我互补，与其他双链靶基因序列没有明显的同源性。为避免枯燥无味的设计，节省时间，减少错误，可应用计算机程序优化设计、选择、确定寡核苷酸引物。 2. 模板DNA： 溶解模板DNA于含有低浓度的EDTA（