(一)温度与时间的设置

基于PCR原理设置变性、退火、延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短的靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外，退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度下Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

1．变性温度与时间

模板DNA和PCR产物变性不充分是PCR失败的主要原因。DNA在其链分解温度Tm时的变性只需几秒钟，但反应管内达到丁。还需一定时间，变性温度过高会影响酶活性。一般情况下，93～94℃min足以使模板DNA变性，适宜的变性条件是95℃×30s，或97℃×15s，若低于93℃则需延长时间。使用较高的温度是适宜的，特别是对G+C比较丰富的模板序列。变性不完全，DNA双链很快复性，因而减少产量。在变性中，温度过高或反应时间过长，对酶的活性有影响，有可能导致酶活性损失，此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，也会导致PCR失败。为提高起始模板的变性效果，保存酶活性，常常在加入Taq酶之前95℃先变性7～10min，再按94℃的变性温度进入循环方式，这对PCR成功有益处。Taq DNA聚合酶活性半衰期在92．5℃为2h以上，95℃为40min，97℃为5min。

2．退火温度与时间

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，所以引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间取决于反应体系的基本组成及扩增引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。实际使用的退火温度要比扩增产物在PCR条件下的真实Tm值低5℃。对于20个核苷酸，G+C含量约50％的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。Taq DNA聚合酶的活性温度范围很宽，退火温度在55～72℃会得到好的结果。在典型的引物浓度时(如0．2μmol／L)，退火仅需数秒即完成。如增加退火温度会增强对不正确的退火引物的识别，同时能降低引物3’端不正确核苷酸的错误延伸。因此，严格规定退火温度，特别是前几个循环中，会增加扩增的特异性。为了在开始循环中就获得最大的特异性，应在第一次变性之后、引物退火之前加入Taq DNA聚合酶。如果退火温度低，dNTP的浓度高，容易使引物错误延伸。因此，一些PCR的研究者建议PCR的扩增使用两种温度范围效果较好，55～75℃为退火和延伸温度，94～97℃为变性温度。

引物的复性温度可通过下列公式帮助选择：

Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)

复性温度=Tm一(5～10℃)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60s。

3．延伸温度与时间

Taq DNA聚合酶虽能在较宽的温度范围内催化DNA的合成，但不合适的温度仍可对扩增产物的特异性、产量造成影响。PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃(较复性温度高10℃左右)，此时TaqDNA聚合酶具有最高活性，但常用温度为72℃，温度过高不利于引物和模板的结合。

延伸反应的时间长短取决于模板序列的长度和浓度以及延伸温度的高低。在最适温度下，核苷酸的掺人率为35～100nt／s，这也取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质等，一般1kb以内的DNA片段，延伸1min；3～4kh的靶序列需3～4min；扩增10kb则需15min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，但在循环的最后一步延伸时，为使反应完全，提高产量，可将延伸时间延长4～10min。如果底物浓度非常低时，较长的扩增时间对初期循环是十分有利的，在稍后的循环中，当扩增产物的浓度超过酶的浓度(约1μmol／L)时，dNTP减少，适当增加引物延伸时间对扩增有较好的帮助，所以最后一轮延伸时间常定为5～7min。

(二)循环次数

循环次数决定PCR扩增程度，而PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度；一般的循环次数在30～40次，此时PCR产物积累即可达到最大值，刚刚进入“平台期”。即使再增加循环次数，PCR产物量也不会再有明显的增加。“平台期”是指PCR后期循环产物的对数积累趋于饱和，并伴随0．3～1pmol靶序列的累计。随着循环次数的增加，一方面由于产物浓度过高，以致自身相结合而不与引物结合，或产物链缠结在一起，导致扩增效率降低；另一方面，随着循环次数的增加，Taq DNA聚合酶活性下降，引物及dNTP浓度下降，易发生错误掺入，非特异性产物增加，循环次数越多，非特异性产物的量也随之越多。

因此，在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次数。