影响PCR的因素

PCR即聚合酶链式反应，基本原理是以DNA为模板，设计一对与模板DNA互补的寡核苷酸片段（引物），在DNA聚合酶的催化作用下，按照5’到3’的方向呈指数扩增目的基因片段。影响PCR的因素主要包括两个大的方面，即反应体系和循环时间。

1、反应体系

反应体系主要包括六种基本要素，即PCR buffer，Mg2+，dNTP，引物，模板和酶。

①PCR buffer的作用是给DNA聚合酶提供一个最合适酶催化反应的条件。PCR buffer的主要缓冲成分是Tris-Hcl，起作用是在实际的PCR过程中，保持反应体系的Ph在6.8-7.8之间。PCR buffer中还有一些物质，例如KCL，NaCL，BSA或明胶或TWEEN20及DTT等均起到酶的保护剂的作用。目前Takara公司销售的一般都是10*PCR Buffer，使用时使得终浓度为1*PCR Buffer就行。有些Buffer中含有镁离子，有些不含有镁离子，如果是后者在反应体系中还需要加入适量的镁离子。

②Mg2+在dNTP和核酸骨架之间起到桥梁作用，能够增加PCR的扩增效率。镁离子浓度过高，会降低反应的特异性，镁离子浓度过低会影响PCR产量，甚至是导致PCR扩增失败，研究表明镁离子浓度在1.5mM-2.5mM之间效过最佳。

③dNTP的质量和浓度与PCR扩增效率有密切的关系，dNTP浓度过高会导致错配，浓度过低会降低产量。dNTP的推荐浓度是20-200umol/L之间，一般都使用200umol/L。

④引物，引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。要想获得较优的引物，得遵循很多基本原则，最基本的是引物的长度，GC含量及Tm值要适中，不能有引物二聚体，交叉二聚体，不能有错配等。设计一个较优的引物关系到PCR的成败及产物的特异性。

⑤模板，一般人的基因组DNA模板推荐使用量最高，大概为0.1-1ug，大肠杆菌基因组DNA为10ng到100ng，质粒DNA为0.1-10ng。模板量过高会导致非特异片段的出现，相反模板量过低会降低反应效率。

⑥酶的浓度过高会导致非特异性条带的产生，酶量过低会降低效率。一般pcr反应的推荐酶量是1.5U/50ul。

2、循环时间

①预变性：93-96℃，通常是94，模板DNA偏大时，适当升高预变性温度，可设为95℃，时间为3-5min，通常为3min，1个循环，预变性的作用是使模板DNA的二级结构充分打开，使得退火过程中引物能够充分结合到模板上；

②变性：93-96℃，通常是94，目的条带偏大时，适当升高预变性温度，可设为95℃，时间为5-30s，通常为30s，变性的作用是使目的DNA的二级结构充分打开，使得退火过程中引物能够充分结合到已扩增的目的DNA上；

③复性：50-72℃，通常根据引物的Tm值决定，Tm-5℃，5-90s，通常为30s，过长的退火时间会增加引物与模板的碰撞几率，增加非特异性条带的产生，退火温度过高，特异性较强，但是效率不高，退火温度过低特异性降低，效率会升高；

④延伸：68-72℃，一般为72℃，温度跟酶的最佳活性有关，时间根据扩增的目的片段的长度而定，一般是1kb/1min，如果酶的效率高，可以根据说明书设定；

重复②③④构成循环，通常为25-45个循环，一般为30或35，循环数过多会增加非特异性条带的产生；

⑤补平延伸：68-72摄氏度，通常是72,5-10min，1个循环，是使产物延伸完整,循环中每个延伸时间虽然从理论上来说已经可以足够延伸完全了,但有的循环可能没有完全达到我们所设计好的要求,所以最后一步是为了完全使每个产物都能够完全的延伸

⑥终止反应，一般是4℃保温