入门指南

2024-07-08 01:14| 来源: 网络整理| 查看: 265

随着进入后基因组时代，第三代分子标记应运而生，目前，SNP（单核苷酸多态性）已成为当下热门研究课题之一，其应用非常广泛。农业领域，能够进行性状基因的精细定位、分子辅助育种、种子资源鉴定等；在医学领域，可进行疾病的分子遗传机制研究、疾病基因定位、药物敏感或疾病易感性位点筛选等。

针对SNP基因分型，KASP技术自面世以来，以其超高的灵活性、准确度和性价比迅速抢占市场，被业内称为“基因分型研究者指尖跳跃的珠链”。如何采取KASP进行基因分型，一起来看看吧！

什么是KASP 技术？

KASP™ 是指竞争性等位基因特异性PCR (Kompetitive Allele Specific PCR)，可对广泛的基因组DNA 样品，包括复杂基因组DNA 样品，对目标SNPs 和特定位点上的InDels 进行精准的双等位基因分型。

KASP技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光引物，它基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，这大大降低了LGC KASP的试剂成本，既有金标准的准确，又降低了使用成本，比Taqman还具有更好的位点适应性，所以在医学、农学检测方面LGC KASP都有非常好的应用。

KASP 技术的特点： · 超高的准确度和转化率 · 前所未有的低成本 · 简单快捷的结果分析

KASP 准备工作

一般来说，在订购KASP Assay mix 时有两种选择： KASP-by-Design (KBD)：引物由专业的软件设计，未经实验室验证 KASP-on-Demond (KOD)：经过LGC基因分型实验室优化与验证需要根据实验室的荧光读取仪选择最合适的KASP Master mix。 * 提示：Master mix根据仪器的不同配置相应浓度的ROX，其他组分一样。当收到KASP Assay mix 和Master mix 后，解冻后进行涡旋振荡。 *提示：KASP Master mix 应该分装储存，避免反复冻融。进行DNA 样品的制备和稀释，以保证每个反应有和其基因组大小相应的DNA 量。

KASP 试验步骤

Step 1. 将DNA 样品分装到PCR 板上将DNA 样品加到96 孔或384 孔PCR 板上，每块PCR 板或每次试验，建议上均需加2 个及以上的阴性对照(NTC)。小编建议：尽量避免使用8 连管或单体管进行KASP 反应，DNA 样品尽量在20 个以上。 Step 2. 配制KASP 基因分型混合液参照下表，分别配制反应所需的混合液。 *提示：所有试剂使用前均应短暂地涡旋振荡，配制时需要加上损失的体积，保证配制足够的基因分型混合液。

Step 3. 将KASP 基因分型混合液加到已含DNA 模板的PCR 板上使用移液枪或微量分液仪，将所需的Step2 中的基因分型混合液加入PCR 板中。 Step 4. 将反应板密封后离心用荧光透视的膜将PCR 板密封，然后离心。 Step 5. 进行PCR 循环反应 KASP 反应可以在常规的PCR 仪上进行，程序设置如下：

Step 6. 荧光数据读取和分析 PCR 反应结束后，使用您实验室的qPCR 仪或者带有FRET功能的酶标仪进行荧光数据读取。 *提示：KASP 分型的数据读取均应在40℃以下进行。

具体的荧光读取方法，请参考对应的仪器手册。

Step 7. 加循环若您的数据对应的荧光信号较低，分群较散，您可以增加循环后进行荧光读取，建议根据试验结果来决定增加的循环数，同时保证NTC 没有被扩增。程序设置如下：

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