实验来源

人外周血

主要试剂

(1)1640培养基

(2)胎牛血清（FBS）

(3)Human GM-CSF

(4)Human IL-4

(5)Human TNF-a

(6)PBS

(7)青霉素-链霉素溶液（100X）

(8)DMSO

(9)台盼蓝粉末

(10)人外周血淋巴细胞分离液

主要试剂配制

（1）PBS：PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，高压灭菌，4℃保存备用。

（2）RPIM-1640培养基：临用前根据需要加15%胎牛血清，最后按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。

（3）台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100mL，1500rpm离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。

实验步骤

一、PBMC原代分离步骤

1) 抽取人的外周血于肝素抗凝管中，取足5mL新鲜血液，加入PBS按1：1稀释血液（一般采血管2mL+2mL）。

2) 取淋巴细胞分离液5mL于15mL灭菌离心管中待用。

3) 吸取稀释血液，在离分层液上方1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。

4) 室温，离心2000rpm，20min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。

5) 小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500rpm，10min。

6) 去上清液，加入1640培养基1mL混匀，取少量进行细胞计数。

7) 用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，5-10min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。计数200个细胞，计算活细胞百分率，活性应在95％以上。

二、DC细胞诱导

1) 将收集的PBMC在1640培养基，在37 ℃、5 % CO2条件下在培养板培养4h。

2) 轻轻吸取上清，收集贴壁细胞，加入含15%血清，100ng/ml rhGM-CSF、100ng/ml rhIL-4的1640培养基，培养5～7d获得未成熟DC，用25ng/ml hTNF-α刺激2～3天，获得成熟DC。

3) 用倒置显微镜观察细胞形态，至细胞毛刺样突起，有典型DC形态悬浮细胞。

三、注意事项：

细胞最好在细胞贴壁注：分离后细胞最好在贴壁后当天换液（贴壁细胞贴壁能力很弱，润洗时轻柔），过夜后部分细胞漂浮，细胞得率减少。

四、常见问题解答：

1、人外周血单个核细胞分离后培养，有很多针尖大小的圆形细胞，是什么东西，如何去除？

我觉得可能是血小板其密度很低，主要在血浆中，吸膜层最好小心点，尽量不要吸到过多血浆，血浆含有血小板，影响不会很大，后面换液可去除，或者分离后细胞多洗几遍，最后用1000rpm低离心去除，就可以了。

2、DC细胞最长可养多长时间？

DC是无法扩增，维持时间我养了3周也没问题，到那时候细胞还没有死，我看有人可以养更久，但养久了太费因子，最好根据实验及时处理。如果你需要长时间培养就最好节省因子（消耗太贵）可以考虑IL4用半量，3天半量离心换液补因子。

细胞形态

48h开始发现半悬浮细胞增多，3～4d细胞开始出现不规则形状，5～7天开始出现成簇现象，细胞出现不规则毛刺，hTNF-α刺激 2～3天，随着培养时间延长，成簇细胞逐渐散开，细胞表面毛刺状突起更明显。

PBMC细胞形态：

DC细胞形态

诱导第4d

诱导第6d

DC诱导成熟

干货

如何复苏可以提高单个核细胞活力？

复苏步骤的优化，对于复苏后细胞的活力很重要。

丹麦的Bo Langhoff Hønge等人对复苏过程中各个存在变数的步骤进行了不同的摸索（如下图），优化结果发表在PLOS ONE上。

评估方法采用CD45选取白细胞，然后用7-AAD标记死细胞，计算活细胞比例，如下图：

1、复苏时间

两种选择，37度水浴至部分融化（1分15秒左右）或完全融化（5分钟左右），均不影响PBMC绝对数和活力。

2、洗涤液的选择

对六种洗涤液进行了评估：BSS、FBS、PBS、RPMI、S-RPMI（小牛血清）、S-RPMI（人血清），其中FBS洗涤获得的PBMC活力最高（96.1％），不过与S-RPMI（人血清）、S-RPMI（小牛血清）还是比较接近的（分别为95.7％和95.2％）。不过，S-RPMI（小牛血清）的活PBMC细胞回收率最高。

3、洗涤液的温度

测试了20％S-RPMI（小牛血清）37度预热和4度预冷两种温度，预热到37度的洗涤液获得的PBMC活力比4度明显高（分别为96.9％和81.0％）。

4、PBMC和复苏洗涤液的混合方式

测试了两种混合方式：将PBMC倒入洗涤液、将洗涤液逐滴加入PBMC。两种方式无显著差异，获得的活PBMC比例分别为96.9％和96.1％。

5、离心温度

离心温度测试了20度和37度两种。两者无显著差异。

6、离心时间和离心力

测试了三种方式：500g×10分钟、300g×10分钟、300g×5分钟，三者获得活PBMC比例分别为95.3％、95.9％、95.8％，不过500g离心10分钟活PBMC的回收率最高。

7、孵育时间

第二次洗涤液重悬PBMC时，作者将PBMC置于5％CO、37度孵箱中测试了0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、8小时、16小时。0.5小时和1小时获得的活PBMC比例最高，但回收率无显著差异。

总结

总结一下上面的内容，复苏时最佳的条件是使用20％S-RPMI（小牛血清），预热至37度，离心力和离心时间设置为500g×10分钟，最后PBMC的孵育37度30分钟～1小时。

END

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