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分析测试百科 » 经验共享 » 【求助】人外周血单核细胞的分离、培养
2014-8-2 17:55
glass
[size=2]
单核细胞？
单个核细胞？
外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有ficoll和percoll两种。[/size]
2014-8-2 17:56
dragonkilly
请教楼主：这个步骤的目的是什么？为什么要这样做呢？PBMC不是悬浮型细胞么？这些未贴壁细胞都是些什么成分？
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[size=2]
单核细胞是贴壁细胞，淋巴细胞是悬浮细胞，据此可分离两种细胞。
曾听说单核细胞贴壁不是很牢固，但是我的感受是单核细胞贴壁相当牢固。我先是震荡，细胞没脱落；我用枪吹打，也没脱落，以为力度不够，换巴氏管猛烈吹打，还是没脱落；然后用胰酶边消化边摇晃，持续一分多钟仍有约20%没掉下来。而且我觉得消化下来的多是老弱病残，真正年轻力壮有活力的仍然贴在培养瓶上。百思不得其解，我的培养瓶是一次性塑料的，也没有经过特殊处理，为何贴壁这么牢固？望高人指点。[/size]
2014-8-2 17:56
loli
[size=2]
楼上的PBMC怎么这么牢固啊?????
我的用吸管稍稍用点力气一吹，就下来啦……
我同实验室的，他们也普遍是这个情况啊……[/size]
2014-8-2 17:57
bluelake
[size=2]顶！我也正在提单核细胞，没有这位师兄做得好，希望能多交流！
出于人道不想在自己还没有完全搞清楚的情况下用人血做。之前用老鼠，效果不理想，明天想用检验科做血常规的废血做一下。可是一打听，那用的是EDTA抗凝管，看的文献是肝素，不知对单核有没有影响？还有这样的血算不算无菌，我提单核也是用来做细胞实验的，没什么大碍吧？急[/size]
2014-8-2 17:58
bluelake
[size=2]
师兄用的是多大的培养瓶？[/size]
2014-8-2 17:58
箭头儿
[size=2]好像有点乱。
首先搞清楚“外周血单个核细胞 peripheral blood mononuclear cells 即PBMC”和“单核细胞 Monocyte”是两个不同的概念，前者包括单核细胞、T细胞、B细胞等。体外培养能贴壁的，应该是单核细胞，不贴壁的当然是T、B等其他细胞了。你也可以用密度梯度离心法分离PBMC后，再用抗CD14的免疫磁珠分离单核细胞，优点是分离出的单核细胞较均一，活性好。加GM-CSF、IL-4、LPS等培养后可分化为树突状细胞DC。估计你是想获得DC吧。
以下是我用过的分离、保存PBMC的Protocol，供参考。可根据所需体积作相应调整。
B. Separation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
1.Fill in all required information on data sheet “Cryopreservation of Peripheral Blood Mononuclear Cells.”
2.Remove the rubber stoppers from the vacutainer tubes. Wipe off the top of each tube with an alcohol swab.
3.Transfer the blood to an appropriate size flask using a sterile pipet. Dilute the blood 1:1 with RPMI 1640. Use approximately 10 ml RPMI 1640 to rinse the vacutainer tubes, and combine with the rest of the blood.
4.Transfer 13 ml Ficoll (warmed to room temperature) to each 50 ml centrifuge tube needed to process the entire sample.
5.Carefully layer the diluted blood over the Ficoll.
6.Centrifuge at 2000 rpm for 15 minutes with centrifuge brake OFF.
7.Collect the cell band at the interface from each centrifuge tube, and transfer it to fresh centrifuge tubeMoon. Add RPMI 1640 for a final volume of 45 ml in each centrifuge tube. Centrifuge at 2000 rpm for 5 minutes. Remove the supernatant, combine the cells in all of the tubes into one tube in 45 ml RPMI 1640. Count the cells.
C. Cryo-preservation of isolated PBMC
1.Centrifuge cells at 2000 rpm for 5 minutes. Remove the supernatant.
2.Resuspend the cells at 20 x 106 cells/ml in freezing solution (50% FCS, 40% RPMI 1640, and 10% DMSO).
3.Transfer 1 ml of cells into each 1.8 ml cryovial that is labeled with donor’s name, hospital number, date, and cell type.
4.Transfer all cryovials to a pre-cooled freezing chamber and freeze using the appropriate program.
5.Once the program is complete, transfer the cryovials to a liquid nitrogen freezer[/size]
2014-8-2 17:58
dragonkilly
[quote]原帖由 [i]箭头儿[/i] 于 2014-8-2 17:58 发表 [url=http://bbs.antpedia.com/redirect.php?goto=findpost&pid=705129&ptid=345267][img]http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif[/img][/url]
好像有点乱。
首先搞清楚“外周血单个核细胞 peripheral blood mononuclear cells 即PBMC”和“单核细胞 Monocyte”是两个不同的概念，前者包括单核细胞、T细胞、B细胞等。体外培养能贴壁的，应该是单核细胞，不贴壁的当然 ... [/quote]
[size=2]多谢指点，确实有点乱，概念模糊，我把上面的帖子整理一下，有不妥的地方请继续指正。
还想请教一下，单核细胞体外培养需要加那些东西？我看见有人加地塞米松还有1，25（OH）2D3，这些是必须的吗？
谢谢！[/size]
2014-8-2 17:59
dragonkilly
楼上的PBMC怎么这么牢固啊?????
我的用吸管稍稍用点力气一吹，就下来啦……
我同实验室的，他们也普遍是这个情况啊……
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[size=2]这么好吹吗？我用20%新生牛血清1640+谷氨酰胺，一次性塑料培养瓶，你用的什么，差距怎么会这么大来？不解。[/size]
2014-8-2 17:59
yes4
[size=2]谢谢指教，对PBMC以及单核细胞的了解又加深了不少！[/size]
2014-8-2 17:59
dragonkilly
[quote]原帖由 [i]bluelake[/i] 于 2014-8-2 17:58 发表 [url=http://bbs.antpedia.com/redirect.php?goto=findpost&pid=705127&ptid=345267][img]http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif[/img][/url]
师兄用的是多大的培养瓶？ [/quote]
[size=2]5的培养瓶，蓝盖的。不知道这么描述准确吗。
老鼠的血跟人的血的比重恐怕有差别，你用FICOLL分离效果可能会不好。检验科化验用的血每个人才几毫升量太小，而且不够新鲜，我也好像看过文献EDTA确实也有影响。所以你还是做出点牺牲，抽自己的吧，随抽随做，新鲜量又足，也不会有不人道感觉。
你要养这种细胞，希望分享你的经验和心得，共同进步。
你有没有加什么刺激因子？[/size]
2014-8-2 18:00
bohe221
[size=2]
我已做过半年多的单个核细胞分离及培养，一点小经验和各位分享和讨论
1.FICOLL分离液，如果是人血，密度为1.077，我做的是兔的，所以密度为1.0965，也用1.077分离过，效果还可以
2.肝素抗凝时，我一般是一支肝素（2ml：12500U）抗凝20ml血液，另外待分离血要与PBS 1：1混合
3.如果有血凝块会影响分离效果（有些微小血凝块，可能看不出来），可以分别用7、6、4号针头抽吸三次
4.5ml抗凝血轻叠加在5ml FICOLL分离液上，离心 1500rpm，20min
5.培养基：IMDM+20%胎牛血清
6.加入细胞因子：IL-3、IL-6、TPO、SCF、Flt-3、GM-CSF（单个核细胞的培养对微环境的要求很高，所以要加一些因子，尽量接近体内状态。不过即便如此，电镜下观察也会发现细胞线粒体肿胀很明显。）
总之，个人感觉单个核细胞不是很好培养。为保证长期培养，对培养基要求比较高，还要加入多种细胞因子，自然花费也很高。
祝各位实验顺利[/size]
2014-8-2 18:00
baidukk
[size=2]像是做破骨细胞哦！单个核细胞具备向其它细胞分化的能力，需要加入的细胞因子是看培养方向而定的。不帖壁的细胞一般活力差，留下来对培养不利，主要是毒性作用。至于贴的太牢固不好脱壁的问题，多半是你的胰酶有问题[/size]
2014-8-2 18:01
dragonkilly
[size=2]1.step11培养的是“单核细胞”还是“单个核细胞”？前面站友提到单个核细胞包括单核细胞和淋巴细胞。如果是单核细胞，它是贴壁的，在长期培养时加入这么多细胞因子，肯定会刺激单核细胞向其他细胞类型分化，不知道会不会影响您的试验？如果是淋巴细胞，您是怎么分离T淋巴细胞和B淋巴细胞的？
2.你好，我的胰酶应该没有问题，况且porcelaine站友在没用胰酶的条件下只是吹打就能让细胞脱壁，而我却不能，不知道是什么原因？另外我的胰酶里面加了EDTA，这个对单核细胞影响大不大？据说杀伤力很大，以后不敢再加了。
希望两位继续关注，谢谢！！[/size]
2014-8-2 18:01
tangxin_80
[size=2]这个是我们科现在做的提细胞的方法,拿出来大家共享!
荧光定量PCR技术检测白血病融合基因前单个核细胞的提取
1. 我们使用新鲜骨髓作为检测该项目的标本。当天标本要求当天处理，进行分离单个核细胞的操作。标本要求均为EDTA抗凝，肝素抗凝标本在PCR扩增过程中会影响扩增效率。
2. 标本来到后，准备15毫升高压消毒后的玻璃离心管，在离心管壁上作好患者姓名，编号的登记，防止混淆。
3. 将注射器中的骨髓标本注入玻璃离心管中。
4. 在已加入标本中的玻璃离心管中加入0.9%的生理盐水或者高压消毒后的PBS液，进行骨髓液的稀释，用滴管上下抽吸至混匀即可，不要猛烈至起泡沫。
5. 在另外的新的高压消毒后的离心管中，加入冰冻的人淋巴细胞分离液，每管大约为3－4毫升。
6. 用滴管将骨髓液体缓慢吸取，转移至装有淋巴细胞分离液的离心管中，轻轻的将标本打出到分离液的表层。
7. 离心机中离心，时间为20分钟，转速为2000转每分钟。
8. 离心后将玻璃离心管轻轻取出，注意不要晃动，造成分层的界限不清。
9. 用滴管将中间的白细胞层轻轻吸出，转移至高压灭菌后的2毫升EP管中。在EP管盖上做好姓名等标记，在小离心机中离心，速度1000以下，时间5分钟。
10. 取出EP管，用滴管或者加样枪将液体层取出，丢弃。此时可以看到沉降在EP管底部的单个核细胞层。
11. 再次用生理盐水或者PBS将细胞打散并且稀释，此步骤主要是为了清洗细胞，除去遗留的红细胞等。尽量不要残留过多的红细胞，会影响PCR检测的效率。
12. 再次按照步骤9离心，离心后取出EP管，去除上清液。
13. 加入生理盐水或者PBS液体，显微镜下计数。根据细胞数目进行分管。细胞数目按照Trizol的说明书进行分装。
14. 加入Trizol时，用加样枪反复抽吸至泡沫丰富，充分混匀，没有可见的细胞沉淀，溶液均一。如不进行提取RNA的步骤，将加了Trizol的细胞保存在－80摄氏度。[/size]
2014-8-2 18:01
pengke1983
[size=2]我培养的是单个核细胞，广义的单个核细胞是指除了成熟红细胞、血小板、分叶粒细胞之外的所有细胞。我们平时所说的单个核细胞一般都是狭义上所指的单核细胞、淋巴细胞等。另外在这里面还含有一定量的造血干细胞，量在0.1-0.3％左右。加入细胞因子是为了里面的干细胞增值形成集落，达到细胞扩增的目的。
作用机制如下：SCF直接调节造血干细胞、早期祖细胞增殖和分化，还能抑制细胞凋亡；但SCF在体外单独使用活性不高，与IL-3、G-CSF或EPO联合具有明显的协同刺激作用；与IL-6、IL－11合用促进C-Kit＋（SCF受体）造血细胞的增殖而不分化。IL-6是目前协同SCF刺激人早期造血细胞扩增作用最强的细胞因子。IL-3主要刺激祖细胞的增殖和分化。IL-3为多潜能集落刺激因子，刺激粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞等多种造血细胞分化成熟，还可作用于多能和定向造血干细胞。
另外，需要明确的是，无论单核细胞还是淋巴细胞都是终末细胞，是不会在体外增值的，所以随着培养时间的延长细胞会逐步死亡。单个核细胞因为含有一定的干细胞，在细胞因子作用下可以增值分化，保证细胞扩增以满足实验的需求。
至于“夏雨X”，因为不知道你的实验到底是什么要求，我只好泛泛尔谈。你最好先确定自己到底需要的是哪种细胞，要达到什么实验目的，然后再决定实验方案以及购买的试剂等，毕竟细胞因子太贵了。[/size]
2014-8-2 18:02
dragonkilly
我培养的是单个核细胞，广义的单个核细胞是指除了成熟红细胞、血小板、分叶粒细胞之外的所有细胞。我们平时所说的单个核细胞一般都是狭义上所指的单核细胞、淋巴细胞等。另外在这里面还含有一定量的造血干细胞，量在0.1-0.3％左右。加入细胞因子是为了里面的干细胞增值形成集落，达到细胞扩增的目的。
作用机制如下：SCF直接调节造血干细胞、早期祖细胞增殖和分化，还能抑制细胞凋亡；但SCF在体外单独使用活性不高，与IL-3、G-CSF或EPO联合具有明显的协同刺激作用；与IL-6、IL－11合用促进C-Kit＋（SCF受体）造血细胞的增殖而不分化。IL-6是目前协同SCF刺激人早期造血细胞扩增作用最强的细胞因子。IL-3主要刺激祖细胞的增殖和分化。IL-3为多潜能集落刺激因子，刺激粒细胞、巨噬细胞、巨核细胞等多种造血细胞分化成熟，还可作用于多能和定向造血干细胞。
另外，需要明确的是，无论单核细胞还是淋巴细胞都是终末细胞，是不会在体外增值的，所以随着培养时间的延长细胞会逐步死亡。单个核细胞因为含有一定的干细胞，在细胞因子作用下可以增值分化，保证细胞扩增以满足实验的需求。
至于“夏雨X”，因为不知道你的实验到底是什么要求，我只好泛泛尔谈。你最好先确定自己到底需要的是哪种细胞，要达到什么实验目的，然后再决定实验方案以及购买的试剂等，毕竟细胞因子太贵了。
......
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[size=2]感谢您的详细讲解，看来您确是有研究的，我还欠缺不少，为了少走弯路节省时间，我把我的实验方案用站内短消息发给您，请你抽时间帮我看一下，[/size]
2014-8-2 18:02
dragonkilly
由于各位的大力支持和指导，细胞长势喜人，小弟在此多谢了！
后续实验问题将在其他帖子里请教，请多关注，谢谢各位！！
2014-8-2 18:03
ending
[size=2]请问如果要促使单核细胞分化为巨噬细胞，应该加入什么细胞因子刺激？[/size]
2014-8-2 18:03
kuohao17
[size=2]可以加佛波酯(PMA），100nmol/l[/size]
2014-8-2 18:03
junhun
[size=2]
想知道单个核细胞的最佳接种密度，能告知。不加刺激剂的直接接种密度[/size]
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