真菌Talaromyces stipitatus的次生代谢产物研究目前只报道4篇。早在1982年Lynn等首次从T. stipitatus中获得具有螺缩酮结构的Talaromycins A和B，发现其可阻断钾离子外流，进而导致肌功能障碍[1]。时隔10多年后从该种中发现了柄状青霉酸，同时探讨其生物合成途径[2]。Zang等从该种中发现聚酮类化合物Talaroenamines A–E，其中Talaroenamines D对氯喹耐受的Plasmodium falciparum疟原虫具有显著的抗疟活性[3]，作者在进一步研究工作中，还分离得到聚酮类化合物9a-epi-bacillisporin E，Bacillisporins A和Bacillisporins F−H，其中Bacillisporin A可显著抑制革兰氏阳性菌生长，Bacillisporin H可抑制Hela肿瘤细胞和金黄色葡萄球菌生长[4]。

含异戊烯基的Dibenzo[b, e]oxepinone类化合物(6-7-6三环系统)的天然产物有17个，绝大多数分离自不同种的真菌，如Arugosins G-H分离自真菌Emericella nidulans var. acristata[5]，Arugosin K-N源自Talaromyces flavus[6]，Cephalanones D-E从Graphiopsis chlorocephala中获得[7]。此类化合物生物活性研究报道较少，抗菌方面的Arugosins H对Mycotypha microspora和Chlorella fusca有抑制活性、Arugosins A和B的混合物对Bacillus megaterium有抗菌活性[5]。抗肿瘤方面的Arugosins A和B的混合物在浓度10 μg/mL时对多株肿瘤细胞表现出中等强度抑制活性[5]。

本课题组对威海附近海域的近海底泥进行了真菌分离，从中筛选出一株具有抗菌活性的真菌WH4-2 (T. stipitatus)，发现含异戊烯基的dibenzo [b, e] oxepinone类化合物是其抗菌成分。本文对该菌株的种属鉴定、化合物提取分离、结构鉴定及抗菌活性测试工作进行报道。

主要仪器与试剂：Bruker AV-600型核磁共振仪测定；Autopol Ⅲ-S2型自动旋光仪测定；分析型液相色谱仪为HITACHI L-2000配L-2455 DAD检测器，色谱柱为Apollo RP-18 (5 μm，4.6 mmx250 mm)；半制备高效液相色谱仪为LabTech LC600配UV600紫外检测器，色谱柱用Kromasil RP-18 (10 mmx250 mm)；上海新科318-MC高速双波长酶标仪；色谱用硅胶(200–300目)和ODS (50 μm)分别购于阿拉丁和YMC公司；分析级和色谱级的甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚均购于国药集团化学试剂有限公司。

菌株来源：真菌WH4-2菌株分离自山东威海附近海域的近海底泥(采样时间为2015年10月)，标本现存放于扬州大学海洋科学与技术研究所。

从–80 ℃超低温冰箱中取出保种的菌株，放置至室温，夹出含有菌丝的菌块，贴放于PDA (土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L、海盐30 g/L和琼脂18 g/L)培养基上，28 ℃倒置培养3–5 d，获得纯菌落。250 mL锥形瓶中装入100 mL的PDB液体培养基，120 ℃高温灭菌，接种适量复苏好的菌落，摇床28 ℃、120 r/min振荡培养3 d，获得种子液。1000 mL锥形瓶中装入400 mL的PDB液体培养基，高温灭菌，按1:40的接种量加入种子液，接种100瓶，28 ℃，静置培养40 d，获得发酵液约40 L。

在PDA固体培养基上，菌落正面呈黄白色，质地絮状，菌丝体短，边缘呈轮纹状(图 1)。菌丝形态显微结构见图 2-A，环境扫描电子显微镜照片见图 2-B，在扫描电镜下观察菌丝直径约2 μm，分生孢子单链排列，链短，呈卵圆形，约2 μm×4 μm。测定菌的ITS序列(生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析)，序列进行BLAST检索，发现菌株WH4-2与Talaromyces stipitatus AC2401的相似性达99%，选取12株相似率较高的菌株，应用MEGA 5软件，分析并构建系统进化树(图 3)，并进行了1000次bootstraps检验，发现菌株WH4-2与Talaromyces stipitatus聚为一枝，结合其形态特征和分离鉴定的化合物结构类型，鉴定菌株WH4-2为Talaromyces stipitatus，GenBank序列号为MG877637。

测试菌种：Staphylococcus aureus ATCC43300，S. aureus ATCC33591，S. aureus ATCC25923，S. aureus ATCC29213，Enterococcus faecalis ATCC51299，E. faecium ATCC35667，Escherichia coli ATCC25922，Bacillus subtilis ATCC6633。

测试菌LB培养基(g/L)：酵母膏5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，纯水1 L。固体培养基加入18 g琼脂粉。

滤纸片法[8]。将灭菌后的LB固体培养基倒入培养皿中(直径为90 mm)，移取已配好的菌液加入平皿中，用涂布器将菌液涂布均匀，用甲醇将样品配制成浓度为50 mg/mL的溶液，吸取3 μL (即150 μg/片)滴加到直径为6 mm滤纸片上，挥干溶剂，将加药面贴服于培养基上，每个样品做2组平行，将贴好滤纸片的培养皿封口后置于28 ℃恒温培养箱中倒置培养18–24 h，测量抑菌圈直径。

微量稀释法[9]。将备好的细菌种子培养液稀释为原来浓度的1:800。取96孔微量稀释板，在板的第1排加198 μL菌液后加2 μL样品，其他孔加100 μL菌液，吸100 μL第1排中混匀的样品及菌液，依次往下加，作2倍递减浓度稀释，最后每个孔补齐200 μL，每个浓度设3个平行。设氨苄青霉素钠和万古霉素阳性对照，培养基空白对照组以及DMSO阴性对照，置28 ℃培养18–24 h，用酶标仪600 nm测吸光度，获得抑制率公式(1)和最小抑菌浓度(MIC)。

收集菌株PDB培养液1 L，用含有5%丙酮的乙酸乙酯液萃取2次，收集乙酸乙酯，减压浓缩得粗提物375 mg。运用滤纸片法，发现粗提物在浓度150 μg/片对多株测试菌有显著抑菌圈(表 1)。对该菌株进行规模化发酵，发酵液过滤，收集培养液40 L，用含有5%丙酮的乙酸乙酯液萃取2次，收集乙酸乙酯，减压浓缩得总浸膏18 g。浸膏经硅胶减压柱色谱，以氯仿/甲醇系统梯度洗脱，得到12个组分，对每个组分进行滤纸片法抗菌活性分析，其中二氯甲烷洗脱下来的Fr.A (1.5 g)对多株测试菌表现出强抑制活性(表 1)。Fr.A经硅胶常压柱色谱，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，得到5个组分，其中石油醚:乙酸乙酯=30:1洗脱下来的Fr.A-1 (400 mg)为抗菌活性组分(表 1)。Fr.A-1经半制备HPLC纯化，流动相甲醇:水=90:10得到化合物1和2 (5.0 mg)、3和4 (7.2 mg)以及5 (20.0 mg)。

运用微量稀释法对化合物1–5进行抗菌活性复筛。

化合物1和2的混合物为黄色粉末，二氯甲烷和甲醇均可溶。HRESI-MS给出准分子离子m/z 377.1376 [M+Na]+ (计算值为：377.1359)，确定其分子式为C21H22O5，不饱和度为11。1H NMR，13C NMR结合HSQC谱提示21个碳由10个季碳，6个CH，1个CH2和4个CH3组成。1H NMR从低场往高场，显示出2个OH活泼质子δH 13.63 (1H, s, 10-OH)和δH 11.46 (1H, s, 14-OH)；4个芳质子δH 7.34 (1H, d, J=8.2 Hz, H-8), 6.94 (1H, s, H-3), 6.87 (1H, s, H-15), 6.57 (1H, d, J=8.2 Hz, H-7), 芳质子δH 7.34和δH 6.57相互偶合，提示这2个芳质子处于相邻位置；2个烯质子或连氧质子δH 5.65 (1H, s, H-5)和5.32 (1H, s, H-2’)；1个甲氧基δH 3.57 (3H, s)；1个亚甲基δH 3.33 (2H, d, J=7.2, H-1’)；3个甲基δH 2.38 (3H, s, H-1), 1.77 (3H, s, H-4’)和1.73 (3H, s, H-5’)。进一步通过2D NMR解析并比对文献，确定化合物1和2的平面结构为arugosin K (图 4)，1H NMR数据归属如下(表 2)。化合物1, 2的13C NMR数据如下：13C NMR (100 MHz, CDCl3):dC 197.6 (C-12, C), 162.9 (C-10, C), 162.5 (C-14, C), 154.7 (C-6, C), 147.3 (C-2, C), 138.6 (C-4, C), 137.8 (C-8, CH), 133.4 (C-3’, C), 125.0 (C-9, C), 121.9 (C-2’, CH), 119.7 (C-15, CH), 117.0 (C-3, CH), 117.0 (C-13, C), 113.8 (C-9, C), 109.4 (C-7, CH), 103.5 (C-5, CH), 57.1 (5-OCH3), 28.0 (C-1’, CH2), 26.0 (C-4’, CH3), 22.0 (C-1, CH3), 17.9 (C-5’, CH3)。由于C-5为手性碳，需要进一步确定其立体构型，化合物1和2的混合物[α]20 D0° (c 0.50, CHCl3)，推测其是外消旋体。查阅文献[6]，暂鉴定化合物1为5S-arugosin K，化合物2为5R-arugosin K。

化合物3和4的混合物为黄色粉末，二氯甲烷和甲醇均可溶。1H NMR谱图显示与化合物1、2极为相似，除了低场区(δH 14-11)活泼质子化学位移差别相对较大外，其他信号基本一致，推测是1、2的结构异构体。经文献比对[6]，确定3和4的平面结构为Arugosin M (图 4)。3和4的混合物[α]20 D0° (c 0.50, CHCl3)，暂鉴定化合物3为5S-arugosin M，化合物4为5R-arugosin M[6]。化合物3、4的1H NMR数据归属如表 2所示。

化合物5为黄色粉末，二氯甲烷和甲醇均可溶。1H NMR中显示δH 7.0–8.0间有5个芳质子，δH 12.0附近有2个羟基活泼质子，此外δH 2.47 (3H, s)是芳环上甲基，与前面化合物比较，5缺乏1–4中间环上的次甲基质子(δH 5.65, 5.71)，推测该化合物为普通蒽醌类化合物，醌核上分别被2个羟基和1个甲基取代，芳质子δH 7.11 (1H, d, J=1.9 Hz, H-2)和7.66 (1H, d, J=1.9 Hz, H-4)提示醌的一个苯环是间位取代，醌的另一个苯环为单取代。具体取代位置，通过比对文献[10]，确定5为Chrysophanol (图 4)。化合物5的1H NMR数据归属见表 2。

抗菌活性按微量稀释法进行，MIC数值见表 3。由于化合物1–5对测试菌S. aureus ATCC25923、S. aureus ATCC29213、E. coli ATCC25922和E. faecalis ATCC51299的MIC数值均 > 100 μg/mL，这4株测试菌结果未列于表 3中。化合物1和2的混合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌S. aureus ATCC43300、屎肠球菌E. faecium ATCC35667和枯草芽孢杆菌B. subtilis ATCC6633的最小抑制浓度均为25 μg/mL，对S. aureus ATCC33591无活性。化合物3和4的混合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌S. aureus ATCC33591和E. faecium ATCC35667的最小抑制浓度为12.5 μg/mL，对S. aureus ATCC43300和B. subtilis ATCC6633的最小抑制浓度为25 μg/mL。化合物5仅对E. faecium ATCC35667表现出弱活性，MIC为50 μg/mL。

含异戊烯基的dibenzo[b, e]oxepinone类化合物的生源合成途径是由9, 10蒽醌发生氧化裂解，还原以及异戊烯基化衍生而来，异戊烯基多以C-C键直接连在苯环上，也有部分异戊烯基通过醚键与苯环相连[11-12]。此类化合物分离难度较大，多以结构和光学异构的形式混合存在，其中有些光学异构体可以运用手性柱进行拆分，而互变异构体只能以混合形态存在，如Arugosins A和B[5]，化合物CAS: 160585-91-1和Arugosin N [7]。

本实验采用抗菌活性导向法对真菌T. stipitatus中的抗菌活性成分开展分离鉴定和活性分析工作。1–4为含异戊烯基的dibenzo[b, e] oxepinone类化合物，为光学异构体(5R和5S)混合物，5是9, 10-蒽醌类化合物。体外抗菌实验发现1–4对多株测试菌均有抑制活性，3和4的外消旋体抗菌活性普遍优于1和2的外消旋体，5对所有测试菌几乎无抑制活性。构效关系分析，9, 10-蒽醌(5)经氧化裂解，还原以及异戊烯基化形成含异戊烯基的dibenzo[b, e]oxepinone类化合物(1–4)，其抗菌活性显著增强，推测中间的氧杂蒎酮是其活性中心。苯环上异戊烯基取代在羟基的对位(3和4)其抗菌活性要优于异戊烯基取代在羟基的邻位(1和2)。1–4光学纯化合物抗菌活性如何？互为对映异构体的两个单体化合物其抗菌活性是协同作用还是拮抗作用？由于样品量的原因，未能完成手性拆分。化合物1–5对S. aureus ATCC292和E. faecalis ATCC51299未表现出抑制活性，但粗提物可抑制这两株病原菌，分析发酵产物中可能还存在其他抗菌物质有待进一步发现，或者可能是化合物间存在协同效应。

本研究从真菌T. stipitatus中分离得到含异戊烯基的dibenzo[b, e]oxepinone类化合物，丰富了该种的化合物结构类型。发现化合物1–4对多株测试菌有不同程度抑制活性。实验结果为抗菌药物的研发提供了先导化合物，也为后继抗菌药物的联合用药研究提供了思路。