使用说明： 1. 样品的准备： a.细胞样品的准备：对于贴壁细胞，约1×106个细胞(大约相当于6孔板一个孔长满的细胞数量)，吸净培养液，按照每100万个细胞加入200μl提取液的比例用移液器加入200μl的NAD+/NADH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；对于悬浮细胞，约1×106个细胞，600×g离心5分钟，吸净培养液，按照每100万个细胞加入200μl提取液的比例用移液器加入200μl冰浴预冷的NAD+/NADH提取液，并轻轻吹打，以促进细胞的裂解；裂解过程在室温或冰上操作均可。随后12,000×g，4ºC离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。 b.组织样品的准备：冰上预冷的PBS洗涤组织后，称取约10-30mg的组织样品，用剪刀剪碎，置于匀浆器中，按照每10mg组织加入200μl提取液的比例加入200-600μl的NAD+/NADH提取液在室温或冰上进行匀浆。随后12,000×g，4ºC离心5-10分钟，取上清作为待测样品备用。 注：细胞或组织裂解得到的样品提取液中含有一些酶，可能会消耗NADH。如果希望获得更加理想的检测结果，建议裂解后用超滤管(10kDa)(FUF051)超滤离心，收集超滤后的样品用于后续测试。细胞或组织量较大、提取液用量较少时，得到的样品提取液可能会较为粘稠，导致吸取不便，请严格按照每100万个细胞或10mg组织加入200μl提取液的比例加入NAD+/NADH提取液进行细胞或组织样品的提取，只要吹打均匀，通常情况下不会出现不便吸取的情况。推荐使用增强型NAD+/NADH检测试剂盒(WST-8法) (S0176)，可有效解决在提取细胞和组织样品时可能出现的粘稠问题。 2. 试剂盒的准备工作： a. NADH标准品的配制：吸取655μl NADH配制液，充分溶解本试剂盒提供的5mg NADH后即得到10mM NADH标准品。10mM NADH标准品请适当分装后-80℃避光保存。 b. NADH标准曲线的设置：将10mM的NADH标准品用NAD+/NADH提取液稀释成适当的浓度梯度，如初次检测可以设置0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10μM这几个浓度，检测时96孔板中每孔加入20μl的标准品，相当于每孔为0、5、10、20、40、80、120、160、200pmol的NADH。如有必要，在后续的实验中可以根据样品中的NADH含量对标准品的浓度范围进行适当调整。其中浓度为0μM的点为空白对照点，仅含NAD+/NADH提取液。注意：由于NADH很不稳定，故配制后需尽快使用。 c. 乙醇脱氢酶工作液的配制：将乙醇脱氢酶用反应缓冲液稀释45倍，例如2μl乙醇脱氢酶加入到88μl的反应缓冲液中，即可获得90μl的乙醇脱氢酶工作液。每个标准品或样品的检测需要使用90μl的乙醇脱氢酶工作液，请根据所需检测的标准品和样品的数量，配制适量的乙醇脱氢酶工作液，并注意现配现用。 3. 样品测定： a.样品中NAD+和NADH的总量的测定：吸取20μl用NAD+/NADH提取液稀释后的待测样品至96孔板中，为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。 注：为获得理想的检测效果，建议将细胞样品稀释2-10倍、组织样品稀释5-50倍后进行测定，也可以同时设定多个稀释倍数。后续如果发现样品中的NAD+和NADH的总量过高，超出标准曲线的范围，则需要加大样品的稀释倍数；总量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量或者降低样品的稀释倍数。 b.样品中NAD+、NADH 的含量或者NAD+/NADH比值的测定：吸取50-100μl待测样品于离心管中，60ºC水浴或PCR仪上加热30分钟以分解NAD+。如果加热后产生不溶物，则需10,000×g，室温或4ºC离心5分钟，吸取20μl用NAD+/NADH提取液稀释后的上清液作为待测样品至96孔板中，为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。 注：为获得理想的检测效果，建议将细胞样品稀释2-10倍、组织样品稀释5-50倍后进行测定，也可以同时设定多个稀释倍数。后续如果发现样品中的NAD+或NADH的含量过高，超出标准曲线的范围，则需要加大样品的稀释倍数；含量过低时则需要加大细胞或组织样品的用量或者降低样品的稀释倍数。 c. 请参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。加入乙醇脱氢酶工作液后充分混匀。

d.37℃避光孵育10分钟。说明：此孵育步骤的目的是将样品中的NAD+转化为NADH；在加入乙醇脱氢酶工作液的过程中须轻柔操作，以免产生气泡。若不慎出现气泡，可使用细小的吸头或针头戳破。 e.适当混匀显色液，然后每孔加入10μl显色液，混匀，37ºC避光孵育10-20分钟，此时会形成橙黄色的formazan。测量450nm处的吸光度。如果显色较浅，也可以适当延长孵育时间至30-60分钟。 4. 样品中NAD+/NADH量的计算： a. 计算标准品组中每个点的平均吸光度，减去空白对照组的吸光度，即为各个标准品的吸光度。 b. 以NADH的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。NADH标准品的检测效果请参考图2。

图2.碧云天NAD+/NADH检测试剂盒(WST-8法) (S0175)检测NAD+和NADH的标准曲线。上图显示本试剂盒可以很好地检测出NAD+和NADH的含量，并且不会受NADPH的干扰。不同的检测条件下，实际读数会因标准品的配制、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。 c. 根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的NAD+和NADH总浓度或者NADH的浓度。未60℃加热处理时，检测得到的是样品中NAD+和NADH总量的浓度(NADtotal)；60℃加热处理后，检测得到的是样品中NADH的浓度。 备注：根据检测得到的浓度及样品的体积，即可计算出NAD+、NADH、NADtotal的量。 d. 根据如下计算公式，计算样品中NAD+的量以及NAD+/NADH的比值。此时可以把NAD+和NADH总量或各自的含量用单位细胞数量或单位组织重量中的含量来表示。一些细胞和组织中NAD+和NADH的含量和比值可以参考图3和图4。 [NAD+] = [NADtotal] - [NADH] [NAD+]/[NADH] = ([NADtotal] - [NADH])/[NADH]

e. 如果希望更加精确地来表述NAD+和NADH总量或各自的含量，可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中NAD+和NADH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。 相关产品：