使用说明： 1.样品的准备： a.细胞样品的准备：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，应避免使用胰酶消化细胞。可以使用EDTA处理细胞或用细胞铲或细胞刮(FLFT021/FSCP023/FSCP029)收集细胞。细胞用PBS或生理盐水洗涤一遍。后续(a)和(b)步骤可以任选其一(优先推荐步骤(a))： (a).可以用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)参考相应说明裂解细胞样品。按照每100万细胞加入100-200微升裂解液的比例进行裂解。如果出现裂解效果不佳的情况，可以把处在裂解液中的细胞样品用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。随后4℃，12000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。 (b).可以用本试剂盒中的样品匀浆液，按照每100万细胞加入100-200微升样品匀浆液的比例用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。随后4℃，12,000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。 b.组织样品的准备：动物用含有0.16mg/ml heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml heparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照约每20mg组织加入200微升样品匀浆液的比例，用TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。4℃，12,000g离心10分钟。取上清用于酶活性的测定。 c.红细胞裂解液的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。取至少500微升全血4℃ 2500g离心5分钟。弃上清，用冰冷的约红细胞沉淀10倍体积的样品匀浆液重悬沉淀，再同前离心，弃上清。加入约红细胞沉淀4倍体积的冰冷的Milli-Q级纯水裂解红细胞。12,000g离心5分钟，取上清。 d.上述各种样品可以用碧云天生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。通常可以先取含1-100微克蛋白的样品用于谷胱甘肽过氧化物酶的检测。注：对于GPx活力较高的组织样品，含1-10微克蛋白的样品可能就能满足检测需求，而对于GPx活力较低的样品例如某些细胞样品，可能需要10-100微克的蛋白量。如果发现样品中谷胱甘肽过氧化物酶的活力过高，可以用谷胱甘肽过氧化物酶检测缓冲液进行稀释。如果样品中谷胱甘肽过氧化物酶的活力过低，则需适当加大蛋白用量。准备好的样品如果当日测定，可以在冰浴保存，如果日后测定可以-70℃冻存。 2.试剂盒的准备工作： a.62.5mM NADPH溶液的配制。在本试剂盒提供的11.5mg NADPH中加入220微升Milli-Q级纯水，溶解并混匀，即为62.5mM NADPH溶液。除立即待用部分外，其余的NADPH溶液需适当分装后-70℃保存。 b.75mM GSH溶液的配制。在本试剂盒提供的10mg GSH中加入433微升Milli-Q级纯水，溶解并混匀，即为75mM GSH溶液。除立即待用部分外，其余的GSH溶液需适当分装后-20℃保存。 c.GPx检测工作液的配制。根据待测定的样品数(含对照)，按照每个检测需要40微升GPx检测工作液的体积配制适量的GPx检测工作液。配制好的GPx检测工作液仅限当日使用，且需尽量在冰浴上存放。具体配制方法参考下表。

d.30mM过氧化物试剂溶液的配制。取21.5微升过氧化物试剂(t-Bu-OOH)加入5毫升Milli-Q级纯水，混匀，即配制成30mM过氧化物试剂溶液。配制好的30mM过氧化物试剂溶液仅限当日使用，且需尽量在冰浴上存放。 e.所有试剂使用前须在水浴中或PCR仪等设备上温育到25℃。 3. 样品测定： a.参考下表，使用96孔板，依次加入检测缓冲液、待测样品和GPx检测工作液，混匀，加入40微升GPx检测工作液后，室温孵育15分钟，以消耗掉样品中的GSSG，排除对后继检测的干扰。

b.每孔加入10微升30mM过氧化物试剂溶液，混匀。 c.立即使用适当的酶标仪或微量紫外分光光度计测定A340，此时记录为0分钟读值。如果仪器可以设置温度，把温度设置在25℃，否则可以通过空调调节室温到25℃，待预计仪器也达到25℃后再开始测定A340。 d.连续测定5分钟或自动每隔1分钟测定一次A340。如果仪器不具备相应功能，可以手工操作，每隔1分钟记录A340值，至少连续记录5分钟，获得6个点的数据。 注1：连续测定的时间可以根据样品中GPx的活力来调整，但是需确保获得6个点的数据。对于GPx的活力较高的样品，例如肝脏等组织样品，建议测定5分钟或10分钟，对应的测定间隔时间设为1分钟和2分钟；对于GPx的活力很低的样品，例如THP-1等细胞样品，可以延长测定时间为10、15或者20分钟，对应的测定间隔时间设为2、3或4分钟。也可以连续测定20分钟，每隔1分钟测定1次，最后取呈线性的时间点前的数据用于分析。 注2：如果样品的第一次读数比如0分钟时A340读值低于1，说明样品中的GPx活力太高，或者样品中本身的GSSG含量太高，需要将样品适当稀释或者减少样品的用量。 e.测定出来的ΔA340/min最好能控制在0.01-0.2范围内。如测定出来的ΔA340/min数值过大，则可以把样品适当稀释或者减小样品的用量，如ΔA340/min数值过小，处理样品时需设法尽量浓缩样品、并适当加大样品的用量。蛋白量为12微克的THP-1细胞样品和蛋白量为4微克的小鼠肝脏样品的检测效果参考表1、表2和图1。 表1.蛋白量为12微克的THP-1细胞样品检测数据分析。

表2.蛋白量为4微克的小鼠肝脏样品检测数据分析。

注：ΔA340 (blank) = A340 (blank) (Time 0)-A340 (blank) (Time n) ΔA340 (sample) = A340 (sample) (Time 0)-A340 (sample) (Time n) ΔA340 = ΔA340 (sample)-ΔA340 (blank) ΔA340/min =ΔA340/n

图1.本试剂盒用于THP-1细胞样品和小鼠肝脏样品的检测效果图。横坐标为测定的各个时间点n，纵坐标为相应时间点ΔA340 (sample)与ΔA340 (blank)的差值即ΔA340。图A为12微克THP-1细胞样品测定15分钟的检测效果，图B为4微克小鼠肝脏样品测定5分钟的检测效果。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。 4.样品中谷胱甘肽过氧化物酶酶活力的计算： a.谷胱甘肽过氧化物酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(1 unit)在25℃，pH8.0，在GSH、谷胱甘肽还原酶、t-Bu-OOH存在的条件下，在1分钟内可以催化1微摩尔NADPH转变成NADP+。1 U=1000 mU。 b.对于谷胱甘肽过氧化物酶溶液：1mU/ml＝1nmol NADPH/min/ml＝(ΔA340/min)/(εμM×L(cm)) 即相当于：[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]=(ΔA340/min)/(εμM×L(cm))=[(ΔA340 (sample)-ΔA340 (blank))/min]/ (εμM×L(cm)) [样品中谷胱甘肽过氧化物酶活力]＝[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]×[稀释倍数]/[样品中的蛋白浓度]= [(ΔA340/min)/(εμM×L(cm))]×[dil×(V(ml)/Vsample(ml))]/[样品中的蛋白浓度] 注：[检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]的单位为mU/ml，[样品中的蛋白浓度]的单位为mg/ml，所以最终[样品中谷胱甘肽过氧化物酶活力]的单位为：U/mg蛋白或mU/mg蛋白； εμM为摩尔消光系数：NADPH在A340的摩尔消光系数为0.00622μM-1cm-1； L(cm)为测吸光度时的路径长度：100μl样品在一般的96孔中的高度约为0.276cm，如果使用不同的反应孔，请注意修改为溶液在该孔中的高度； dil为样品的稀释倍数； V(ml)为反应体系，本反应体系为0.1ml； Vsample(ml)为反应体系中样品的体积，以毫升表示。 c.计算示例：样品的蛋白浓度经测定为1.2mg/ml，用样品稀释液稀释2倍后，取20微升稀释后的样品参考表1进行测定，测定时间设为15分钟。如果0分钟时的A340 (sample)=1.53，A340 (blank)=1.75，15分钟时的A340 (sample)＝0.81，A340 (blank)＝1.35，则ΔA340 (sample)=1.53-0.81=0.72，ΔA340 (blank)=1.75-1.35=0.40，那么： [检测体系中谷胱甘肽过氧化物酶活力]= [ (0.72-0.40)/15]/(0.00622×0.276)=12.43mU/ml [样品中谷胱甘肽过氧化物酶活力]= 12.43mU/ml×(2×0.1/0.02)/(1.2mg/ml)=104mU/mg(蛋白) 相关产品