王钺镁,喻文静,孙袭孟,张 静,路 静,刘培庆

(中山大学药学院,广东 广州 510006)

心肌细胞是终末分化细胞,因此,成年人的心肌细胞通过增加大小来应对异常增加的负荷,维持功能和效率。肥厚是心脏在面对生理、病理性刺激时出现的适应性改变,但病理性肥厚通常发展为心衰。肥厚初期表现为:心肌表面积增加;心室腔变小、室壁变厚;胚胎基因如心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑利钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、心肌β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)被激活。随着病程的发展,将由代偿转为失代偿:线粒体功能障碍、细胞延长、凋亡等使心肌收缩功能受损;心肌纤维化、心室扩张等严重损害心功能,最终发展为心衰[1-3]。

皮层肌动蛋白结合蛋白(Cortactin)是Src激酶80/85 ku的底物,人类Cortactin蛋白由CTTN基因编码[4]。Cortactin具有高度保守的序列,人类、啮齿动物和鸟类的分子结构相似[5]。其N端可激活Arp2/3复合物,与F-肌动蛋白(F-actin)结合,促进肌动蛋白的成核与聚集;其C端Src同源3(SH3)结构域,介导与多种细胞骨架蛋白或支架蛋白的相互作用。近年来,有文献报道在p47phox敲除的小鼠心脏中Cortactin功能失调,肌丝功能受损,不能很好地抵御外界压力[6]。也有文献报道,心肌细胞中N-Cadherin调控Kv1.5通道功能需要Cortactin的作用[7]。

N-cadherin即N型钙黏连蛋白,分子量130 ku,受到钙的保护,定位于细胞黏附体连接处。根据细胞环境不同,可发挥促进黏附或诱导迁移的作用。N-cadherin参与了细胞骨架的重组以及成肌分化过程[8]。研究表明,N-cadherin可增强人多能干细胞来源的心肌细胞在梗死小鼠心脏中的修复能力[9];过表达N-cadherin可调动间充质细胞发挥对缺血性心脏损伤的保护作用[10]。但N-cadherin与Cortactin是否参与了异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)诱导的病理性心肌肥厚,两者是否存在相互作用关系,尚不清楚。基于以上背景,本文就Cortactin、N-cadherin与病理性心肌肥大的关系进行研究,以期探寻病理性心肌肥大的新机制以及新的研究靶点。

1.1 试剂ISO粉末(货号:51-30-9,美国MCE公司);Cortactin抗体(货号:11381-1-AP)、α-Tubulin抗体(货号:11224-1-AP)、N-cadherin抗体(货号:22018-1-AP)、GAPDH抗体(货号:10494-1-AP)、荧光二抗,均购自中国Proteintech公司;利钠肽A(natriuretic peptides A,ANF)抗体(货号:sc-515701,美国Santa Cruz公司);β-MHC抗体(货号:M8421,美国Sigma公司);RNA逆转录试剂盒、SYBR Premix EX Taq、BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher公司);RNAiso Plus(日本TaKaRa公司);DAPI、5-BrdU(美国Sigma公司);罗丹明鬼笔环肽、Lipo-2000、转染专用培养基(美国Invitrogen公司)。

1.2 实验动物健康C57BL/6小鼠20只(雌雄各半),体质量20～25 g,购自上海南方模式生物科技有限公司,实验动物质量合格编号:201900020004 59。饲养于中山大学实验动物中心(东校区)屏障环境,实验动物使用许可证号:SYXK(粤)2021-0112。实验动物伦理审查申请编号:2021001193。

1.3 仪器CO2恒温培养箱、全自动细胞组高内涵筛选分析系统、荧光定量PCR仪、Evos XL Core细胞成像系统(美国Thermo Fisher公司);FV3000激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司);5840R台式低温高速离心机(德国Eppendorf公司);5200型化学发光凝胶成像系统(上海天能公司);电泳仪、电转仪(美国Bio-Rad公司)。

2.1 原代心肌细胞培养酒精棉球擦拭SD大鼠乳鼠(1～3日龄)胸腹部皮肤,开胸,将心脏放入含有预冷PBS的平皿中,洗去残血并摘除结缔组织,随后将心脏剪成大小适当的小块,转入无菌锥形瓶中。PBS洗涤后,加入12.5 mL胰酶(1 g·L-1),冷消20 min。用磁力搅拌器水浴搅拌消化,控制温度为37 ℃左右,消化5 min。每次消化结束后,将消化液转入15 mL离心管中,1 500×g离心5 min。重复上述操作至组织块消失,将收集的细胞转到培养瓶中,在CO2培养箱中差速培养1～2 h,使成纤维细胞贴壁,与心肌细胞分开。收集上层培养基,加入双抗和5-BrdU,按需求稀释并接种细胞。培养至心肌细胞贴壁(通常为24 h左右),用PBS洗去未贴壁细胞,并换入新的含5-BrdU的培养液继续培养、处理即可。

2.2 RT-qPCR检测弃去培养基,预冷的PBS清洗,随后用TRIzol收集细胞。加入氯仿,剧烈颠倒震荡至液体乳化分层。静置离心后,将上层液体转至新的EP管中。加入异丙醇,轻柔混匀,静置,离心,RNA沉淀在底部。用预冷的DEPC水配制的75%乙醇洗涤沉淀,离心、弃上清,开盖室温干燥。以DEPC水为溶剂,58 ℃空气浴辅助溶解RNA 10 min后,测定其浓度和纯度。使用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。参照SYBY Premix ExTaq的说明书,进行反应体系构建。引物由上海生工公司合成,采用 β-actin为内参基因。β-actin引物:正向5′-CCAAGACGGCAGACGAAGTTCC-3′,反向5′-AAGTTCCGCCCTTCCTTTCCAATG-3′;ANF引物:正向5′-CTGGGACCCCTCCGATAGAT-3′,反向5′-CACTCTGGGCTCCAATCCTG-3′;BNP引物:正向5′-AGTCTCCAGAACAATCCACGATGC-3′,反向5′-GCCTTGGTCCTTTGAGAGCTGTC-3′;β-MHC引物:正向5′-CCAGAACACCAGCCTCATCAACC-3′,反向5′-CACCGCCTCCTCCACCTCTG-3′;Cortactin引物:正向5′-GAAGCACGCCTCCCAGAAAGAC-3′,反向5′-CAGCACTCTTGTCTACACGGTCAG-3′。

2.3 Western blot检测心脏组织经称量、机械剪碎、PBS洗涤等步骤,加入适量含蛋白酶、磷酸酶抑制剂的RIPA重悬,通过超声破碎组织细胞、释放蛋白;细胞经贴壁、加药处理后弃去培养基,用PBS清洗干净,加入适量的RIPA裂解液,刮下细胞转至EP管中,冰上裂解30 min后,4 ℃、12 000×g离心15 min,吸取上清。蛋白定量后,将制好的样品进行电泳,后转至PVDF膜上。封闭,一抗、二抗孵育并洗涤后,使用ECL化学发光检测试剂盒显影,检测ANF、β-MHC、Cortactin、N-cadherin蛋白变化。

2.4 心肌肥大动物模型的建立及取材C57BL/6小鼠随机分为ISO模型组和生理盐水(normal saline,NS)组,每组10只(雌雄各半)。模型组小鼠皮下注射5 mg·kg-1·d-1的ISO,连续5 d,随后以7 mg·kg-1·d-1的剂量再给药2 d。经超声心动检测模型建立成功后,称体质量,并用异氟烷麻醉小鼠后,迅速打开胸腔,由心尖处注射适量0.1 mol·L-1KCl溶液,使心脏处在舒张末期。取材后的小鼠量取胫骨长后,统一收集进行无害化处理。取出的心脏经清洗、称体质量、拍照后,沿中部横切,部分用4%的多聚甲醛固定后包埋成蜡块,制作切片;剩余部分存放于-80 ℃冰箱,提取组织蛋白进行Western blot实验。

2.5 免疫荧光共定位将H9c2细胞接种在confocal皿中并处理。弃去培养基,用温浴过的PBS清洗细胞(此后每步操作前均需用PBS清洗)。加入1 mL 4% 的多聚甲醛,室温避光固定10 min;加入200 μL 0.3%的Triton破膜10 min;加入即用型山羊血清室温30 min或4 ℃过夜封闭;加入Cortactin或N-cadherin抗体(1 ∶200)4 ℃过夜孵育;加入荧光二抗(1 ∶200),室温避光1 h;1×DAPI染核10 min,清洗干净后用激光共聚焦扫描显微镜拍照。

2.6 细胞水平干预Cortactin

2.6.1过表达Cortactin 采用Cortactin腺病毒(Ad-cttn)感染或载体为pcDNA3.1(+)并携带大鼠Cortactin编码区的质粒,转染原代心肌细胞36 h,空载腺病毒(Ad-con)为对照组。病毒购于上海维真生物有限公司。

2.6.2siRNA干扰Cortactin 加入Cortactin干扰序列,降低其表达。siRNA干扰使用转染专用培养基和Lipo-2000进行瞬转。3条干扰序列分别为转染后4～6 h换液,继续培养36 h,然后提取蛋白或RNA。对构建的干扰序列进行预实验筛选,选择效果最好的进行实验。Cortactin的3条干扰序列分别为Cttn-Rat-1 sense:5′-GCAAGAUAGGAUGGACAA ATT-3′,antisense:5′-UUUGUCCAUCCUAUCUUGCTT-3′;Cttn-Rat-2 sense:5′-GCAAAUACGGAAUUGACAAT T-3′,antisense:5′-UUGUCAAUUCCGUAUUUGCTT-3′;Cttn-Rat-3 sense:5′-CCAGUAAUAUUCGUGCUAATT-3′,antisense:5′-UUAGCACGAAUAUUAC UGGTT-3′。

2.7 原代心肌细胞表面积测定细胞分为对照组、ISO组、过表达Cortactin组、过表达Cortactin+ISO组、si-Cortactin组和si-Cortactin+ISO组。每步操作前均用PBS清洗3次。细胞处理完成后,弃去培养液并清洗干净,加入4%多聚甲醛固定15 min后,弃去多聚甲醛,室温干燥10 min。加入0.3%的Triton破膜10 min。使用罗丹明-鬼笔环肽于37 ℃避光孵育30 min,使细胞骨架染色。1×DAPI染核10 min后,用细胞全自动高内涵筛选分析系统测定细胞表面积。

3.1 ISO诱导的心肌细胞模型中Cortactin蛋白水平降低原代心肌细胞经心肌肥大刺激剂ISO(10 μmol·L-1)处理后建立模型。与对照组相比,ISO处理后的心肌细胞表面积明显增加(Fig 1A);肥大指标β-MHC和ANF的蛋白水平明显上调(Fig 1B);ANF、BNP、β-MHC的mRNA表达也明显上调(Fig 1C),提示心肌细胞肥大模型构建成功。随后检测了Cortactin蛋白水平的变化,发现其蛋白表达随时间的延长而逐步降低(Fig 1D)。同时免疫荧光法检测了Cortactin蛋白在细胞内的定位及表达情况(Fig 1E),发现Cortactin蛋白定位于胞膜和胞质中,与文献结果一致;且与对照组相比,ISO刺激24 h后,Cortactin的蛋白水平明显下调。提示ISO刺激的细胞模型中,Cortactin蛋白表达降低。

3.2 小鼠心肌肥大模型中Cortactin蛋白水平下降为了检验Cortactin蛋白水平的变化在动物和细胞水平上是否有一致性,用ISO构建了小鼠的心肌肥大模型。与NS组相比,ISO处理后,小鼠心脏明显肥厚、心肌排列紊乱、胶原沉积增加,纤维化明显(Fig 2A)。通过小动物超声成像检测小鼠心功能的变化,发现与NS组相比,ISO处理组小鼠心脏射血分数(ejection fraction,EF)、短轴缩短率(fractional shortening,FS)、舒张末期左室前壁厚度(left ventricular anterior wall dimensions at end-diastolic,LVAW;d)、收缩末期左室前壁厚度(left ventricular anterior wall dimensions at end-systole,LVAW;s)、舒张末期左室后壁厚度(left ventricular posterior wall dimensions at end-diastolic,LVPW;d)和收缩末期左室后壁厚度(left ventricular posterior wall dimensions at end-systole,LVPW;s)均明显下降,心质量体质量比(heart weight/body weight,HW/BW)明显升高,心质量胫骨长比(heart weight/tibial length,HW/TL)略有升高,提示动物模型建立成功。随后检测心脏组织肥大指标的mRNA、蛋白水平变化,以及Cortactin蛋白表达变化。RT-qPCR和Western blot结果显示(Fig 2C-E),与NS组比较,ISO组小鼠心脏肥大指标ANF、β-MHC的mRNA及蛋白水平均明显升高,而Cortactin蛋白表达明显降低。体内、体外实验结果具有一致性,表明ISO能明显降低心肌细胞内Cortactin的蛋白水平,提示Cortactin可能是ISO诱导的心肌肥大中的一个潜在保护因子。

3.3 过表达Cortactin可抑制心肌肥大的发生为了探究Cortactin在ISO诱导的心肌肥大中的作用,采用外源性干扰的方法干预其表达。在原代心肌细胞中转染载体为pcDNA3.1(+)并携带大鼠Cortactin编码区的质粒以过表达Cortactin蛋白,检测心肌肥大指标的变化情况。Fig 3A的mRNA检测结果显示,成功在原代心肌细胞中过表达了Cortactin。如Fig 3B所示,相较于对照组,ISO处理组肥大指标ANF和β-MHC的mRNA水平明显升高,而过表达Cortactin能明显抑制ISO诱导的肥大相关指标mRNA的升高。Fig 3C、3D结果显示,过表达Cortactin也能明显抑制由ISO引起的原代心肌细胞表面积的增加,即可以逆转由ISO引起的心肌细胞肥大。

3.4 干扰Cortactin可促进心肌肥大的发生利用siRNA干扰心肌细胞中Cortactin的表达。Western blot和RT-qPCR结果显示(Fig 4A、4B),与对照组相比,单独敲低Cortactin可升高肥大指标ANF、β-MHC的蛋白和mRNA水平。鉴于3条干扰序列对肥大指标的作用相差不大,但si-1对Cortactin的敲低效果较2和3好,选用该条siRNA进行后续实验。由Fig 4C、4D的结果发现,无论是肥大指标蛋白水平的变化,还是心肌细胞表面积的变化,单独使用si-Cortactin的结果与ISO相似,两者叠加使用后,可进一步加剧心肌细胞的肥大程度。以上结果提示,干扰Cortactin的表达具有心肌损伤的作用,更可加重由ISO诱导的心肌肥大,故Cortactin可能具有心脏保护作用。

3.5 Cortactin对ISO诱导的心肌肥大的调控机制为了进一步探讨Cortactin发挥心肌保护作用的具体机制,通过外源性过表达或者干扰的方法影响其在细胞内的表达,并在此基础上检测细胞内N-cadherin蛋白水平的变化。如Fig 5A所示,在ISO诱导的动物模型中,N-cadherin的蛋白水平也明显下降。通过Fig 5B免疫荧光的结果,确认了肥大刺激剂ISO可以降低N-cadherin的蛋白水平。随后干扰Cortactin的表达,发现同样会降低细胞内N-cadherin的蛋白水平,叠加给予ISO后会使这种效果更加明显(与si-Cortactin组对比)(Fig 5C、5E)。而通过Ad-cttn过表达Cortactin后,可以增加细胞内N-cadherin的蛋白水平,且这一效应可逆转ISO导致的N-cadherin蛋白水平的降低(Fig 5D、5F)。结果提示,Cortactin与N-cadherin的蛋白水平变化具有同向性,它们可能通过细胞间的黏附与连接,影响病理性心肌肥大的发生发展。

Fig 1 Level of Cortactin protein decreased in ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy in primary

Fig 2 The protein level of Cortactin decreased in cardiac hypertrophy caused by

Fig 3 Overexpression of Cortactin alleviated ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy in

病理性心肌肥大是一种不可逆转的慢性疾病,并且通常会发展为心衰。当心脏长期暴露于慢性应激或损伤中,心脏会进入肥厚代偿期。在这一阶段,心脏大小和质量增加,也伴随着一系列分子生化、结构和代谢的变化,以维持心脏功能。然而,随着时间的推移,这种变化会导致心室扩张、收缩功能下降,最终发展为心衰。此时,心脏将不能维持向身体供应含氧血液[11]。病理性心肌肥大的发生机制非常复杂,包括代谢失调、自噬异常激活、线粒体自噬增多、钙调节紊乱、儿茶酚胺与内分泌紊乱等[12]。

肾上腺素受体是G蛋白偶联受体超家族的成员,介导儿茶酚胺类肾上腺素和去甲肾上腺素的效应,在心脏功能的调节中起着不可或缺的作用[13]。肾上腺素和去甲肾上腺素对β-肾上腺素受体的刺激可激活典型的Gs-AC-cAMP-PKA信号级联反应。在中枢神经系统的控制下,交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)通过促进神经末梢去甲肾上腺素的分泌来正向调节心功能。SNS-儿茶酚胺-β-肾上腺素受体轴是驱动心脏工作的主要机制,然而SNS的长期激活可导致心脏结构改变(心脏重塑),并可能发展为心衰[14]。ISO为非选择性激动β受体,三型受体均可激活,因此我们选用ISO作为心肌肥大刺激剂来构建细胞和动物模型。根据实验室前期研究基础,采用10 μmol·L-1的ISO刺激原代心肌细胞,成功复制了ISO诱导的心肌肥大模型。采用皮下ISO给药1周的方式,成功建立了小鼠心肌肥大模型。

闰盘(intercalated disc,ICD)作为心肌细胞末端各种细胞表面成分的组织中心,从而确保整个心肌的适当机电偶合。ICD具有3个作用:提供黏附体连接和桥粒;提供机械偶合和间隙连接;提供电偶联。N-cadherin是ICD的重要组成部分,负责维持ICD结构[7]。然而,N-cadherin不能单独支持形态发生和组织稳态,其作用的发挥需要Cortactin 和p120-连环蛋白(p120-catenin,p120-ctn)的协助。Cortactin是一种皮层肌动蛋白结合蛋白,为Src激酶底物,可被Src家族激酶直接磷酸化,促进了Arp2/3介导的肌动蛋白体外组装。p120-ctn可以直接与N-cadherin蛋白相互作用,确保它在细胞表面的稳定[15]。在ICD中,有含Xin重复序列的蛋白,mXinα上存在多个p120-ctn结合位点,且其SH3结合基序能与Cortactin相互作用。它能够将N-cadherin/p120-ctn复合物连接到潜在的肌动蛋白细胞骨架上,这种联系可维持ICD的结构稳定,也可影响细胞黏附性和信号转导。在小鼠心脏中, N-cadherin与Cortactin在ICD的共定位水平很高,而在mXinα缺失的心脏中,这一共定位水平急剧减少[16]。心脏特异性的N-cadherin缺失会导致ICD的分解和自发性致死性室性心动过速。与野生型小鼠相比,心肌细胞条件性敲除N-cadherin小鼠心室肌细胞的动作电位持续时间延长、Kv1.5/Kcne2的表达降低。Kv1.5/Kcne2表达的降低与肌动蛋白细胞骨架的破坏和肌膜接触的减少有关。研究结果表明,在细胞黏附分子、N-cadherin、肌动蛋白结合支架蛋白、Cortactin和心脏中Kv通道重塑之间存在一种新的机制联系[7]。

Fig 4 siRNA targeting Cortactin aggravated ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy in

Fig 5 Cortactin could coact with N-cadherin in ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy in H9c2 and C57BL/6

本实验旨在探究细胞间的黏附与连接在病理性心肌肥大中的作用。本研究发现心肌肥大刺激剂ISO可使Cortactin和N-cadherin的蛋白水平降低,且在细胞中过表达Cortactin时,N-cadherin的蛋白水平也会升高,提示Cortactin和N-cadherin的蛋白变化具有一致性。Cortactin和N-cadherin之间有何关联,它们是通过心肌电生理,还是心肌肌丝的稳定来影响心肌肥大的呢?以后将进一步研究。