图 1 截短体构建

不管是用于wb，IP或者是蛋白纯化，在构建标签的时候，需要考虑标签添加的位置，即N端或者C端。N端有信号肽的蛋白，由于在蛋白转运后，信号肽（signal peptide）将被切除（图2），所以这类蛋白我们一般将标签构建在C端，或者构建在N端信号肽之后。N端有甲硫氨酸切除的蛋白一般也采用这种构建方式，如组蛋白H3（图3）。另外，部分蛋白还存在前体肽（propeptide），在成熟后也将被切除（图4），所以构建标签时也要避免构建到被切除的肽段上。可以在uniprotKB数据库查询自己构建的蛋白是否包含信号肽或者前体肽，或者切除甲硫氨酸。

图 2 信号肽

图 3 首位移除甲硫氨酸

图 4 前体肽

确定蛋白定位对于研究其功能有着重要的启示。通过将一个待研究蛋白和GFP或者RFP等荧光蛋白进行融合，后续通过观察荧光的定位，就能够知晓目的蛋白的位置。其具体应用包括但不限于以下实验目的：

第一， 不确定目的蛋白的细胞定位，通过融合荧光蛋白进行确认；

第二， 用于确认某个结构域或者修饰位点是否影响目的蛋白定位；例如，构建野生型蛋白融合荧光蛋白后观察蛋白定位于细胞核；同时构建缺失某个结构域或者突变某个修饰位点的突变蛋白融合荧光蛋白，观察其蛋白定位是否发生变化；

第三， 观察某个干预过程是否导致影响蛋白定位发生变化，例如调控其他基因表达，或者小分子化合物处理等。

除此以外，荧光蛋白融合目的基因的构建方式还可以用于区分内源蛋白和外源蛋白达量，因为GFP大小在26kd左右。过表达融合蛋白后，使用目的蛋白的抗体进行wb，一般可以杂出两条明显的条带，通过对比条带的亮度，可以区分内外源的表达比例。而如果使用前面介绍的各种标签，由于其分子量很小，分子量在50kd上的蛋白一般就很难跑出两条条带。

荧光蛋白在融合目的基因时也需要考虑是融合在N端或者C端，具体考虑内容和标签蛋白融合时一致。

对于融合荧光蛋白，建议在构建时在目的基因和荧光蛋白中间添加连接肽linker[LS1] ，吉凯基因在构建这类蛋白时一般会添加柔性连接肽，具体内容见后续内容介绍。同时，部分融合荧光蛋白可能出现融合后荧光极弱甚至没有荧光的情况，这可能是融合蛋白内部相互作用影响了荧光蛋白的正确构象，此时可以考虑更换荧光蛋白的位置，如从N端换到C端。还可以考虑更换不同的连接肽序列，尤其是是刚性连接肽进行尝试。

｜连接肽linker的选择｜

原则上讲，所有融合蛋白在构建的时候，都可以添加linker连接肽。通过研究天然的、具有多个结构域的蛋白，研究者发现了天然连接肽的多种特性。在该基础上，研究者设计了多种人工的连接肽，分成两大类，分别是柔性连接肽（flexible linker）和刚性连接肽（rigid linker）。

柔性连接肽用于连接需要有一定活动性和相互作用的两个蛋白或者多肽（图5）。柔性连接肽通常包含小的氨基酸，非极性的如Gly，极性的如Ser和Thr。这些尺寸更小的氨基酸提供了连接肽的灵活性，允许被连接的两个蛋白具有一定的活动性。并且，添加Ser和Thr可以使得连接肽和水分子形成氢键，赋予连接肽在水溶液中的稳定性，从而减少连接肽和前后两个蛋白的相互作用。

目前最主要的柔性连接肽由Gly和Ser残基组成（“GS”linker）。其中使用最广泛的柔性连接肽的序列为（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）n。通过调整n的数值（重复数），该GS连接肽的长度可以得到改变，从而可以最优地分离两个两个连接的蛋白，或使其可以相互作用。除了GS柔性连接肽以外，还有一些其它的柔性连接肽，如KESGSVSSEQLAQFRSLD，EGKSSGSGSESKST，(Gly)8，GSAGSAAGSGEF等。

虽然柔性连接肽具有很多的优点，但是显而易见的，缺乏刚性是其一个很大的限制。有文章报导了柔性连接肽导致融合蛋白表达下降或者生物活性丧失。这很可能是由于柔性连接肽不能将两个蛋白充分地分离，导致其产生了相互作用，进而影响融合蛋白的稳定性或者生物活性。在这种条件下，刚性连接肽，可以被用于完全隔绝两个连接的蛋白，维持他们独立的功能（图5）。

Figure 5 刚性连接肽和柔性连接肽发挥功能示意图

α螺旋结构肽段内部会形成氢键和紧密的结构，因此同时具有稳定性和刚性。利用（EAAAK）n形成成的α螺旋的刚性连接肽被广泛应用于许多融合蛋白的构建。可以看到很多刚性连接肽都采用了α螺旋，典型的如A（EAAAK）nA，或者（H4）2连接肽（A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A）。

除了α螺旋外，还有一类刚性连接肽是富含Pro的氨基酸序列，Pro可以赋予连接肽极强的构象约束。序列为（XP）n，X可以是任意氨基酸，优先选择Ala，Lys，Glu。需要注意的是，如果两个连接的蛋白需要一定的相互作用的话，不建议使用刚性连接肽。并且，可能存在部分特例，两个蛋白并不需要相互作用，但使用柔性连接肽的表达效果优于刚性连接肽的情况。其具体的原因可能还需要进一步地探究。

通过今天的介绍，大家是否对融合蛋白有了更多的认识呢？如果大家有相关产品的需求，欢迎联系吉凯基因进行交流或者订购！

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