1、选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的内贴壁细胞长满时约有10^5个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异且SD值会很大。对于肿瘤细胞，最佳点板浓度在5000/孔左右。

2、药物浓度的设定。提前看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3、时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期），那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4、培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持72h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，建议在72小时后换液。

5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

7.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

8. 最边缘的孔液体易挥发，故不用作实验，边缘孔用无菌PBS填充。

9. 设3-5个复孔，建议设5个，否则难以反应真实情况。

10. MTT的配制。MTT一般最好现用现配，过滤后4°C避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

11. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；关于避光，往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短。

12. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。