血管形成实验从原理、实验步骤及细节到定量分析的详细介绍 – sci666 |
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血管形成实验从原理、实验步骤及细节到定量分析的详细介绍 – sci666
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血管生成（Angiogenesis）是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，其对于器官生长、胚胎发育和伤口愈合在内的多种过程十分重要。 
图片来源 Bing Images
血管形成实验（Tube formation assay）是体外研究血管生成的经典方法，该方法可快速确定参与血管生成的基因或通路。今天给大家分享血管形成实验从原理、实验细节到定量分析的完美攻略！
血管形成实验的基本原理是什么？
内皮细胞保留了分裂和快速迁移的能力，可响应血管生成信号。
哪些细胞可以进行血管形成实验？
多种类型的内皮细胞均可用于本实验，包括原代细胞和永生化细胞系。常用的有人脐静脉内皮细胞（HUVEC），之所以不采用静脉血管内皮细胞与动脉血管内皮细胞是因为HUVEC具有干细胞的潜能，理论上可以传代50-60次。
此外小鼠3B-11细胞、小鼠SVEC4-10细胞或原代内皮细胞也可用于血管形成实验。
实验步骤
1. 准备内皮细胞
（1）以3B-11细胞为例，检测前两天将3B-11细胞传代。细胞传代次数很重要，当细胞在第2代和第6代之间时，血管形成效果最好。使用第2代之前或第10代之后内皮细胞会影响实验效果：
图片来源 参考文献1
（2）细胞在含10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中培养24小时。
（3）实验前一天，血清饥饿3B-11细胞：
先从3B-11细胞中弃去培养基，加入含0.2% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基培养24小时。
2. 实验试剂准备
（1）基底膜提取物（basement membrane extract, BME）购自BD Biosciences公司，Cat Number为354230：
图片来源 根据参考文献1整理
值得注意的是BME浓度因批次而变化很大。如果浓度低于10mg/ml，BME就不能很好工作，因此应该在购买之前联系代理商，以确保获得足够集中批次的试剂。
（2）BME小瓶使用前一天浸入置于4度冰箱的冰中过夜解冻，解冻后，旋转小瓶以确保混匀。融化后的基质胶在15℃以上，会迅速凝固，操作的时候放置在冰上，防止过早凝固。
此外，与基质胶接触的所有培养器皿、耗材和培养液均应预冷，整个实验过程需始终保持基质胶置于冰上。对融化后的基质胶进行分装，需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次冻融。
（3）用于信号通路研究时，低生长因子的BME（Reduced growth factor BME）比起传统的BME更可取，因为排除了生长因子的干扰。
3. 实验前内皮细胞的准备
（1）使用杜氏磷酸缓冲液（DPBS，和常用标准PBS区别是不含钙、镁离子）清洗3B-11细胞，加入适量含EDTA胰蛋白酶消化细胞。
（2）培养基终止消化后使用100μm细胞滤网过滤细胞，去除结块。
（3）在含10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中计数细胞至最终浓度7.5×106个细胞/ml。所种细胞数也会影响血管形成效果，不同细胞类型密度需摸索：
图片来源 参考文献1
4. 血管形成实验
（1）将24孔板和1ml枪头放在冰箱或冰上20-30分钟后再使用，这样BME就不会过早固化。
（2）将250µl低生长因子的BME加入24孔板中，移液过程中避免产生气泡，确保胶完全覆盖孔底。
（3）将24孔板在37°C和5% CO2中孵育30分钟以固化BME。
（4）将大约300µl的培养基与10µl重悬的3B-11细胞(约75,000细胞)混合。根据使用的内皮细胞类型调整培养基的体积和细胞数，例如HUVEC 96孔板每孔细胞数约2-3×104个。
（5）Tubes将在2-4小时内开始形成，这取决于培养基中血管生成因子的浓度，小管形成的峰值可能发生在3到12小时之间，并且需要优化检测的时间。如果使用原代内皮细胞而非永生化细胞，开始成管的时间会延迟几个小时。一般而言成管会在18小时内开始恶化，内皮细胞将发生凋亡：
图片来源 参考文献1
（6）在血管形成的最佳时间小心去除培养基，避免破坏BME上的血管网络。使用1ml DPBS洗涤后加入1ml新鲜DPBS，使用倒置显微镜或荧光/共聚焦显微镜(如果细胞被Calcein AM染色)对管状网络进行成像。当然也可使用4%的多聚甲醛室温固定15min后进行成像。
图片来源 参考文献3
定量分析血管形成网络
血管形成实验量化指标有：
number of tubes; number of loops/meshes; number of branch sites/nodes; length of tubes。
文献中常用的分析指标是branch points与capillary length：
图片来源 参考文献3
今天给大家分享使用ImageJ插件Angiogenesis Analyzer对血管网络进行定量！
Angiogenesis下载地址：https://imagej.nih.gov/ij/macros/toolsets/
图片来源 ImageJ网站
分析步骤：
1. ImageJ软件File -> Open打开待分析图片：
图片来源 Angiogenesis Analyzer网站示例图片（http://image.bio.methods.free.fr/ImageJ/?Angiogenesis-Analyzer-for-ImageJ&artpage=4-6&lang=en#outil_sommaire_4）
也可通过点击Angiogenesis Analyzer插件 下载示例图片：
下载完成后示例图片会保存在文件夹中：
2. 打开Angiogenesis Analyzer文本文件，即可见Angiogenesis Analyzer分析界面：
点击扳手形状选择Settings可设置测量参数：
点击Network analysis分析界面，Angiogenesis Analyzer插件可以分析小管形成明场图片（Phase Contrast）或荧光图片（Fluo）：
本图片为明场图片，点击Analyze HUVEC Phase Contrast，等待分析完成后即可得到分析结果：
3. File -> Save as…即可保存结果到Excel表格，Angiogenesis Analyzer插件可以得到如下诸多结果：
4. Angiogenesis Analyzer插件Analyze Binary Tree也可以分析二值化的网络结构（如神经元、血管等）：
图片来源 实验图片
 最后，如果大家感兴趣可以点击 Open On Line Documentation查阅有关在线文档。
今天给大家分享血管形成实验就到此为止了，希望对大家有所帮助！
参考文献: 1. DeCicco-Skinner KL, Henry GH, Cataisson C, et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. 2014 2. Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. 2012 3. Wüstehube J, Bartol A, Liebler SS, et al. Cerebral cavernous malformation protein CCM1 inhibits sprouting angiogenesis by activating DELTA-NOTCH signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(28):12640-5 |
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